菟絲子提取物對(duì)自然衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及肝和腦組織ATP酶活力的影響

劉海云 紀(jì)玉龍 何志堅(jiān)

(江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004)

衰老是一個(gè)復(fù)雜多變的生物學(xué)過(guò)程，隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體在成年以后即使在正常狀態(tài)下也會(huì)發(fā)生一系列形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化和機(jī)體功能的減退，并逐漸走向死亡的不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象〔1〕。中藥菟絲子是一年生攀緣性的草本寄生性種子植物，是一種常用補(bǔ)陽(yáng)藥物，性平、味辛甘，歸腎、肝、脾經(jīng)，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)肝明目、固精縮尿、安胎止瀉的功效〔2〕。自由基學(xué)說(shuō)是衰老的一個(gè)討論熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)觀察中藥菟絲子對(duì)自然衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO)水平、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和肝腦組織中ATP酶活力的影響并分析其抗衰老作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 昆明種老齡小鼠(12～14月齡)40只,青齡組小鼠(3～4月齡)10只，小鼠由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄各半，許可證號(hào)SYXK(贛)2015-0026。室溫20 ～ 22 ℃，空氣新鮮，通風(fēng)良好，小鼠雌雄分籠固體飼料喂養(yǎng),自由飲水，正式開始實(shí)驗(yàn)前適當(dāng)飼養(yǎng)7 d左右。

1.2試劑 CAT試劑盒、LPO試劑盒、ATP酶活力試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)依次為20150121、20150217、20150214。中藥菟絲子購(gòu)于南昌開心人大藥房。

1.3儀器 微量進(jìn)樣器(德國(guó)Eppendorf公司),恒溫水浴鍋(金壇市榮華儀器制造有限公司)，AdventurerTM電子天平(奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司)，TGL-16G型臺(tái)式高速離心機(jī)(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)，TECAN酶標(biāo)儀sunrise(奧地利TECAN公司)

1.4菟絲子提取物的制備〔3〕稱取菟絲子中藥250 g，加入2 000 ml水浸泡120 min，至菟絲子藥材微脹，微火煎煮2次，每次煎煮時(shí)間30 min，過(guò)濾2次提取液合并一起，至水浴鍋中濃縮至生藥濃度為0.4 g/ml，放于西門子冰箱冷藏，備用。

1.5動(dòng)物分組與給藥 昆明種老齡小鼠，隨機(jī)分為衰老模型組、低、中、高劑量給藥組(菟絲子100、200、300 mg·kg-1·d-1劑量組各10只；青齡組為正常對(duì)照組。菟絲子低劑量、中劑量和高劑量每天灌胃給藥1次,正常對(duì)照組和衰老模型組給予相同體積的生理鹽水灌胃，持續(xù)7 w。

1.6學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試 Y迷宮行為學(xué)的觀察參照文獻(xiàn)〔4〕。在MG-2型Y迷宮(規(guī)格100 mm×150 mm×250 mm)內(nèi)，分安全區(qū)(A)、電擊區(qū)(B)和起步區(qū)(C)。在實(shí)驗(yàn)測(cè)試時(shí)接通電流給予小鼠電刺激，小鼠從C區(qū)接受電擊刺激后，能一次性從C區(qū)直接跳到A區(qū)為正確反應(yīng)，否則屬錯(cuò)誤反應(yīng)。通過(guò)觀察它能否有效避開并正確找到安全區(qū)來(lái)判斷小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)小鼠最后一次給藥60 min后,開始進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力訓(xùn)練，首先把小鼠放入Y迷宮并讓其適應(yīng)6～8 min，再把小鼠放進(jìn)起步區(qū)，接通電流，記錄小鼠接受電擊后的反應(yīng)，并記錄其結(jié)果。注意兩次電擊訓(xùn)練之間讓小鼠休息1 min。如果連續(xù)訓(xùn)練10次都對(duì)或者9次正確即為小鼠已經(jīng)學(xué)會(huì)空間辨認(rèn)。達(dá)標(biāo)時(shí)所需的訓(xùn)練次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績(jī)。1 d后用相同的訓(xùn)練方法再訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)的錯(cuò)誤次數(shù)記為記憶成績(jī)。

1.7肝腦組織及血清的制備 最后一次給藥0.5 h后眼眶取血，放于離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，微量加樣器吸取上清液備用。取血后的小鼠迅速放置于冰上，快速取出肝臟和腦組織,用4℃的生理鹽水反復(fù)沖洗2～3次，洗掉表面的殘血，濾紙拭干后,稱其重量,剪碎組織放入勻漿瓶中，按重量體積比加9倍生理鹽水勻漿10 min，配成10%腦組織和肝臟勻漿液,然后以1 500 r/min離心10 min,取其上清液，再用生理鹽水把上清液稀釋為濃度為2%組織勻漿，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8肝腦組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活力的測(cè)定 取稀釋好的組織勻漿按試劑盒步驟進(jìn)行操作。

1.9統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行LSD法分析。

2 結(jié) 果

2.1各組學(xué)習(xí)記憶能力 衰老模型組與正常對(duì)照組相比，學(xué)習(xí)達(dá)標(biāo)次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)均增多(P<0.01)；給藥組與衰老模型組相比，學(xué)習(xí)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)減少，以中、高劑量組效果明顯(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2各組肝和腦組織中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力 與正常對(duì)照組比較，衰老模型組ATP酶活力顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與衰老模型組比較，低、中、高劑量給藥組臟、腦組織ATP酶活力均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表2,表3。

表1 各組學(xué)習(xí)記憶能力次)

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與衰老模型組相比：2)P<0.01，3)P<0.05；表4同

表2 各組肝組織ATP酶活力

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組相比：3)P<0.05，4)P<0.01；表3同

表3 各組腦組織ATP酶活力

2.3各組血清中CAT活力、LPO含量 與正常對(duì)照組相比，衰老模型組血清中CAT活力均顯著降低而LPO含量顯著升高(P<0.01)；與衰老模型組比較，低、中、高劑量給藥組血清中CAT活力均顯著升高而LPO含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 各組血清中CAT活力、LPO含量

3 討 論

自由基學(xué)說(shuō)是目前衰老學(xué)說(shuō)機(jī)制中被認(rèn)可的一種〔5〕，該學(xué)說(shuō)提出了衰老與自由基關(guān)系密切，在正常生理活動(dòng)過(guò)程中細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生自由基，自由基生成過(guò)多不能及時(shí)清除而導(dǎo)致自由基不斷堆積，生成大量的過(guò)氧化物，最終加速了細(xì)胞衰老并可能進(jìn)一步導(dǎo)致其死亡〔6〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)中藥菟絲子可以清除產(chǎn)生的過(guò)多自由基，直接或間接降低了自由基對(duì)機(jī)體的損害,從而保護(hù)機(jī)體組織因抗氧化性物質(zhì)消耗造成的損傷,從而達(dá)到抗衰老的作用。 ATP酶是一種輔酶，作為能量產(chǎn)生的必需生理物質(zhì)，可參與機(jī)體三大物質(zhì)(糖、蛋白質(zhì)、脂肪)及核酸、核苷酸等代謝過(guò)程，又可以改善機(jī)體代謝。因此ATP酶的活力可準(zhǔn)確衡量細(xì)胞代謝相關(guān)的生命活動(dòng)，是衡量細(xì)胞衰老的最重要指標(biāo)之一。本文表明，處于自然衰老狀態(tài)的小鼠腦組織中Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPsae活性呈下降的趨勢(shì)，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致〔7〕。Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase是細(xì)胞膜上的一類蛋白質(zhì)，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外離子的濃度，可以將細(xì)胞內(nèi)的鈣離子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，從而保持細(xì)胞內(nèi)、外處于鈣穩(wěn)定狀態(tài)。隨著年齡增大，Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性降低，勢(shì)必會(huì)引起這一穩(wěn)態(tài)的失衡，不能保持細(xì)胞內(nèi)低鈣離子濃度，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度超標(biāo)，加速了細(xì)胞的衰老〔8〕，雖然肝腦組織中ATP酶活性受多方面因素的影響，但在降低ATP酶活性方面自由基損傷是最重要的指標(biāo)之一。本文結(jié)果表明，菟絲子取物對(duì)自然衰老小鼠肝腦組織ATP酶活性有明顯的增強(qiáng)效果，從而進(jìn)一步起到延緩衰老的作用。

CAT存在于細(xì)胞膜上，可以對(duì)抗自由基，將體內(nèi)H2O2分解為水而被清除，從而降低體內(nèi)自由基的生成而減少自由基堆積〔9〕。LPO可以讓細(xì)胞功能下降，是細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸與氧自由基相互作用生成的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞失去活性，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞死亡〔10〕。正常情況下，機(jī)體代謝過(guò)程中由于抗氧化能力降低造成體內(nèi)自由基物質(zhì)增加，包括H2O2和羥自由基等，自由基可以氧化細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸，從而形成過(guò)氧化脂質(zhì)加速機(jī)體的衰老〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菟絲子提取物可提高體內(nèi)抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生，增強(qiáng)體內(nèi)自身抗氧化能力，對(duì)延緩衰老能起到一定的積極作用。