石榴3—脫氫奎尼酸合成酶基因的克隆及表達分析

尹燕雷　陶吉寒　楊雪梅

摘要：利用RT-PCR技術從泰山紅石榴（Punica granatum L.）果皮中獲得3-脫氫奎尼酸合成酶（DHQS）基因cDNA序列，分析了其在不同石榴品種發育期果實中的表達情況。結果表明，DHQS基因cDNA序列長273 bp，編碼91個氨基酸，編碼蛋白具有典型的DHQ_Fe_ADH超家族保守結構域。該基因核苷酸序列與歐洲山毛櫸、梅花和蒺藜苜蓿的相似性分別為91%、87%和88%，氨基酸序列與歐洲山毛櫸、蘋果、白梨和擬南芥的相似性分別為95%、92%、92%和88%。兩個石榴品種發育期果皮中DHQS基因相對表達量逐漸降低，均在7月15日出現峰值。整個發育期，泰山紅DHQS基因表達量高于泰山三白甜。

關鍵詞：石榴（Punica granatum L.）；3-脫氫奎尼酸合成酶；克隆；表達分析

中圖分類號：S665.4 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）18-0103-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.18.026 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Cloning and Expression Analysis of 3-dehydroquinate Synthase Gene in Pomegranate

YIN Yan-lei，TAO Ji-han，YANG Xue-mei，TANG Hai-xia，FENG Li-juan

（Shandong Institute of Pomology，Tai'an 271000，Shandong，China）

Abstract： The 3-dehydroquinate synthase（DHQS） cDNA sequence was cloned from Taishanhong pomegranate（Punica granatum L.） pericarp with RT-PCR technique. The expression of DHQS gene was analyzed in different pomegranate cultivars fruits during development. The result showed that the cDNA sequence length of DHQS was 273 bp，which encoded 91 amino acids. The protein of DHQS gene contained DHQ_Fe_ADH superfamily conservative structure domain. The similarity of DHQS nucleotide sequence in pomegranate and Fagus sylvatica，Prunus mume，Medicago truncatula were 91%，87% and 88%，respectively. The similarity of DHQS deduced amino acid sequences in pomegranate and Fagus sylvatica，Malus domestica，Pyrus x bretschneideri，Arabidopsis thaliana were 95%，92%，92% and 88%，respectively. The relative expression level of DHQS gene decreased gradually with the fruit development in two pomegranate cultivars，which peak value appeared at July 15th. The relative expression level of DHQS gene in Taishanhong was higher than that in Taishansanbaitian in the whole development period.

Key words： Punica granatum L.； 3-dehydroquinate synthase； cloning； expression analysis

石榴（Punica granatum L.）種質資源豐富，適應性強，在熱帶、亞熱帶和暖溫帶地區都有栽培[1，2]。沒食子酸、咖啡酸和綠原酸等是石榴中含量較為豐富的酚酸類物質，具有諸多保健功能，逐漸成為目前研究的熱點。

莽草酸途徑與沒食子酸、咖啡酸和綠原酸的生物合成密切相關[3，4]。3-脫氫奎尼酸合成酶（3-dehydroquinate synthase，DHQS）是莽草酸途徑中的第2個關鍵酶，能催化3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate，DAHP）生成3-脫氫奎尼酸（Dehydroquinate，DHQ）[5]。DHQ既參與合成沒食子酸的前體物質3-脫氫莽草酸，又參與合成綠原酸的前提物質奎尼酸和咖啡酸[6，7]。對DHQS基因進行克隆與表達分析為從分子水平揭示植物中酚酸類物質代謝機理提供了理論依據。

目前，DHQS活性測定、基因克隆表達方面的研究在原核生物和真核生物中[8-10]研究較多，植物中DHQS生化特性、分子結構及基因克隆表達的研究僅在獼猴桃[5]、狹葉松果菊[7]、歐洲山毛櫸[11]和柿子[12]中有少量報道，蘋果、梨等果樹上DHQS基因序列主要通過全基因組測序預測得到，石榴中DHQS基因克隆及表達方面的研究至今未見報道。因此，本研究利用RT-PCR技術克隆泰山紅石榴果皮DHQS基因cDNA序列，對其在不同品種中的表達情況進行熒光定量PCR分析，為揭示石榴果實中酚酸類物質代謝的分子機理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種均采自山東省果樹研究所石榴種質資源圃。基因克隆以泰山紅幼果期果實（直徑2～3 cm）為試材，果皮用液氮冷凍后儲存于-80 ℃中備用。

熒光定量表達分析以泰山紅和泰山三白甜不同發育時期的果實為試材。2016年7月15日開始采樣，每隔10 d采1次，直至10月2日成熟時為止。每品種選長勢一致的健壯樹10株，每次采均勻、無病蟲害的果實10個，采后低溫條件下帶回實驗室，果皮液氮冷凍后，于-80 ℃保存。

1.2 保守片段的克隆

利用RNA prep Pure Plant Kit試劑盒提取果皮總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，Nanodrop 紫外分光光度計檢測其質量。按照Thermo Scientific Fermentas反轉錄試劑盒K1622說明書合成cDNA 第一鏈。

根據已知DHQS基因的保守序列設計簡并引物DHQS1：5′-RARRCATGTYCAYGGDAAGA-3′和DHQS2：5′-MCATHACVGTNGTDGGRATCTG-3′。PCR反應體系為2×Ex Taq Buffer 25 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA 5 μL，Ex Taq酶1.0 μL，去離子水15 μL，總體積50 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的片段克隆至pMD18-T Vector送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得中間片段序列[13]。

1.3 序列分析

利用ORF Finder預測序列的開放閱讀框；利用DNAMAN分析序列編碼的蛋白質序列；利用NCBI的BLASTn和BLASTp分析拼接序列核苷酸和氨基酸序列的相似性；用CDD 進行蛋白保守結構域分析。

1.4 熒光定量PCR分析

使用天根RNA prep Pure Plant Kit試劑盒提取不同時期石榴果皮總RNA，利用寶生物工程（大連）有限公司的反轉錄試劑盒PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄合成cDNA第一條鏈。以反轉錄cDNA為模板進行熒光定量PCR。

分別以兩個品種不同時期果皮cDNA為模板，根據獲得DHQS基因序列設計實時熒光定量PCR 特異引物DHQS3：5′-TTAACTAAGGGAAACCCAA ATGTC-3′和DHQS4：5′-AAAGAGGCAGCAGCAAA ACC-3′。熒光定量PCR反應體系按SYBR？誖 Green PCR Master Mix說明書配制，每個樣品設3 個重復。反應體系為SYBR Green Master Ⅰ 10 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，模板1 μL，加去離子水至20 μL。PCR反應程序為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個循環；最后退火至55 ℃，每隔7 s上升0.5 ℃至95 ℃，共81個循環。以石榴Actin（GU376750.1）為內參基因，每個基因擴增均有內參基因同時擴增，默認條件下讀取Ct 值，采用2-ΔΔCT方法，計算其相對表達量。

2 結果與分析

2.1 石榴DHQS基因保守序列的克隆

以石榴果皮cDNA為模板，利用簡并引物DHQS1和DHQS2進行PCR擴增，克隆得到一條長273 bp的目的片段（圖1）。經測序和比對確定其是DHQS基因片段，該基因片段共編碼91個氨基酸（圖2）。

在NCBI數據庫中，將DHQS基因片段的核苷酸序列進行比對，結果表明，其與歐洲山毛櫸（Fagus sylvatica，Accession：DQ166522.1）、梅花（Prunus mume，Accession：XM_008243830.1）和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，Accession：XM_003612164.1）的相似性分別為91%、87%和88%。將其氨基酸序列進行比對發現，其與歐洲山毛櫸（Accession：ABA54866.1）、蘋果（Malus domestica，Accession：XP_008352428.1）、白梨（Pyrus x bretschneideri，Accession：XP_009363469.1）和擬南芥（Arabidopsis thaliana，Accession：NP_8512

79.1）等的相似性分別為95%、92%、92%和88%。由此確認克隆到的片段為石榴果皮DHQS基因，GenBank登錄號為KY200850。

2.2 保守結構域分析

CDD分析表明，石榴DHQS蛋白具有典型的DHQ_Fe_ADH超家族保守結構域（圖3）。

2.3 不同石榴品種DHQS基因表達分析

兩個石榴品種果皮中DHQS基因隨發育時間的增加也呈逐漸降低的變化趨勢，均在7月15日出現峰值（圖4）。整個發育期，泰山紅DHQS基因表達量高于泰山三白甜。在7月15日，泰山三白甜果皮中DHQS基因相對表達量與其他時期差異極顯著（P<0.01）。

3 小結與討論

本研究利用RT-PCR技術從石榴果皮中克隆得到DHQS基因保守片段，具有典型的DHQS基因特征結構域，這與茶樹上[3]的研究結果一致。由于石榴果皮富含多糖多酚物質，提取RNA的純度不能滿足DHQS基因3′端和5′端序列克隆的需要，后續將改進試驗方案，克隆得到DHQS基因全長cDNA序列。

不同石榴品種發育期果皮中DHQS基因的表達量逐漸降低，這與臭氧處理煙草中DHQS基因的表達趨勢[14]基本一致。研究表明，臭氧處理條件下，歐洲山毛櫸葉片中DHQS基因上調表達[11]，這種差異性可能與物種自身的特性有關。DHQS基因在狹葉松果菊花和葉中表達量較高[7]，在第三片茶葉中表達量最高，在頂芽表達量最低[3]。本研究分析了不同品種果皮中DHQS基因的表達情況，不同部位中DHQS基因的表達水平還需深入研究。

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