冷卻速率對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

(天津商業(yè)大學(xué) 天津市制冷技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300134)

現(xiàn)代社會(huì)飛速發(fā)展，生活水平不斷提高，人們對食品營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)注度逐步提升[1]。我國初級果蔬產(chǎn)品占比達(dá)90%，而采摘后損失率達(dá)25%～30%[2-3]。冷凍冷藏可以更好的保存食品品質(zhì)。M. Fuchigami等[4-5]通過對胡蘿卜進(jìn)行冷卻-復(fù)溫，發(fā)現(xiàn)冷凍會(huì)影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和質(zhì)地。T. Acharya等[6]利用低溫顯微鏡研究了細(xì)胞滲透特性在冷卻過程中的變化規(guī)律。但并不知曉冷卻過程中，細(xì)胞內(nèi)冰晶的生長過程。

Li Wei等[7]對細(xì)胞的凍存進(jìn)行了研究，并模擬了胞內(nèi)冰的生長過程。為了更真實(shí)的觀察細(xì)胞內(nèi)冰晶的生長情況，T. Ninagawa等[8]利用高速攝像機(jī)，觀測了不同冷卻速率下草莓天竺葵的葉子細(xì)胞內(nèi)冰晶生長過程，發(fā)現(xiàn)不同冷卻速率會(huì)影響冰晶生長方式及冰晶的大小。細(xì)胞組織的力學(xué)性能和形態(tài)參數(shù)對研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和質(zhì)地的變化至關(guān)重要。J. J. Ordaz-Ortiz等[9]使用拉伸方法測試了番茄組織強(qiáng)度，通過低溫掃描電鏡判定組織破壞機(jī)制。M. C. Alamar等[10]測定了不同品種和不同貯存條件下的蘋果組織的力學(xué)性能和形態(tài)參數(shù)。婁耀郟[11]研究了弱強(qiáng)度的靜磁場對食品冷凍的影響及其影響機(jī)理。宋健飛等[12]研究了直流磁場對洋蔥細(xì)胞凍結(jié)過程的影響。

以上學(xué)者對植物細(xì)胞的冷凍過程、冰晶生長及生物組織的破壞機(jī)制進(jìn)行了大量研究，然而，關(guān)于植物細(xì)胞在冷驅(qū)動(dòng)下的力學(xué)特性研究較少。由于洋蔥的內(nèi)表皮細(xì)胞較大且規(guī)則，易于觀察，因此，本文選取洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞為研究對象，利用低溫顯微鏡，對細(xì)胞的冷卻-復(fù)溫過程進(jìn)行觀察，分析細(xì)胞在不同冷卻速率下冰晶的大小及復(fù)溫后細(xì)胞的形變，研究冷卻速率的影響特性及細(xì)胞冷卻過程中的結(jié)構(gòu)變化。

1 實(shí)驗(yàn)裝置及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)臺(tái)

實(shí)驗(yàn)采用低溫顯微鏡系統(tǒng)，其溫度控制范圍為-196～125 ℃，熱電偶為A級Pt100鉑電阻，精度為±0.01 ℃，溫度響應(yīng)時(shí)間小于0.01 s，可實(shí)現(xiàn)迅速降溫和精確控制。采用循環(huán)氮?dú)獯祾呃渑_(tái)鏡，防止鏡口處形成濕氣凝結(jié)，影響顯微鏡觀測。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及方法

實(shí)驗(yàn)選用市場銷售的洋蔥作為取樣對象，其大小均勻、成熟度一致、無病蟲及損傷。實(shí)驗(yàn)步驟：1)取洋蔥內(nèi)表皮長寬為10 mm×10 mm，其厚度多次測量取均值為0.115 6 mm；2)將洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞置于載玻片，保證平整無氣泡；3)將玻片置于低溫顯微鏡中的樣品池中，調(diào)至清晰；4)設(shè)置冷卻速率為2、6、8、12、15、20、50、90 ℃/min，由常溫降至結(jié)晶點(diǎn)并維持5 min，再以速率10 ℃/min復(fù)溫至常溫，拍照時(shí)間為1 張/s；5)利用Image-Pro Plus軟件，對洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的顯微照片(放大至200倍)進(jìn)行定量分析，記錄細(xì)胞結(jié)晶溫度和結(jié)晶所需要的時(shí)間。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對不同冷卻速率下洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，得到細(xì)胞結(jié)晶溫度、結(jié)晶時(shí)間及細(xì)胞外觀形態(tài)的變化。結(jié)果表明，不同冷卻速率下，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化趨勢相同。以冷卻速率為12 ℃/min的冷卻過程為例，圖1所示為洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞顯微圖片，隨著溫度的降低，細(xì)胞明顯變得褶皺，細(xì)胞間隙逐漸形成冰晶，溫度繼續(xù)下降，直至細(xì)胞完全結(jié)晶。

圖2 洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞時(shí)結(jié)晶照片與3D光強(qiáng)度圖Fig.2 Onion epidermal cell images at the moment of crystallization and 3D light intensity with different cooling rates

2.1 胞內(nèi)冰晶對細(xì)胞損傷的分析

透光強(qiáng)度可反映胞內(nèi)冰晶的形成情況。圖2所示為選取不同冷卻速率下細(xì)胞結(jié)晶時(shí)的照片和通過Image-Pro Plus軟件進(jìn)行處理得到的細(xì)胞結(jié)晶時(shí)的3D光強(qiáng)度圖。淺色部分代表透過細(xì)胞的光，可以看到冷卻速率從2 ℃/min升至90 ℃/min的過程中，淺色對應(yīng)的分布區(qū)域越來越稀少，與之對應(yīng)的結(jié)晶時(shí)的照片顯示越來越暗。圖3所示為洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞結(jié)晶時(shí)的平均灰度值。由圖3可知，冷卻速率為2 ℃/min 時(shí)照片的平均灰度值為44.11%；2～15 ℃/min時(shí)平均灰度值下降了27.5%；2～90 ℃/min時(shí)平均灰度值下降了37.2%。

圖3 洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞結(jié)晶時(shí)的平均灰度值Fig.3 Relationship between the cooling rate and the average gravy value

這說明冷卻速率的快慢，對冰晶的生長產(chǎn)生了影響。當(dāng)冷卻速率較慢時(shí)，冰晶生長過程較為穩(wěn)定，細(xì)胞內(nèi)不易形成晶核，因此晶核的數(shù)量較少。冰晶在生長過程中受到其它冰晶的干擾較弱，形成的枝晶粗大且數(shù)量少，散射能力弱，透光能力強(qiáng)。當(dāng)冷卻速率升高時(shí)，冰晶形成過程的穩(wěn)定程度下降，不僅細(xì)胞內(nèi)形成的晶核變多，而且各個(gè)晶核在冰晶在生長過程中還會(huì)相互干擾，導(dǎo)致生長出的冰晶較為混亂，形成的枝晶小且數(shù)量多，散射能力強(qiáng)，因此細(xì)胞的透光能力下降。顯然，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶較大時(shí)，會(huì)對細(xì)胞造成更大的機(jī)械損傷。

2.2 細(xì)胞形變的分析

有些文獻(xiàn)中采用長短軸之比研究細(xì)胞的形變，其值雖然可以反映細(xì)胞的形變，但內(nèi)因無從得知。假設(shè)細(xì)胞所受載荷是均勻的，細(xì)胞形變與細(xì)胞內(nèi)壓的變化相關(guān)聯(lián)，因此本文在分析細(xì)胞形變時(shí)采用如下計(jì)算式[13]：

(1)

但此公式適用于圓形細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)選取的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞為較為規(guī)則的矩形細(xì)胞。故用當(dāng)量直徑代替式(1)中的半徑，可得式(2)：

(2)

細(xì)胞的面積及周長可通過Image-Pro Plus軟件測量，洋蔥表皮細(xì)胞的當(dāng)量直徑可由式(3)計(jì)算：

(3)

細(xì)胞的體積變化可由式(4)計(jì)算：

ΔV=V-V0

(4)

式中：γ為細(xì)胞壁的泊松比[14]，γ=0.33[14]；E為細(xì)胞壁的彈性模量，E=2.67×107N/m2；h為細(xì)胞壁的厚度，h=0.125×10-5m；L為細(xì)胞的周長，m；S為細(xì)胞的面積，m2；D0為細(xì)胞初始的當(dāng)量直徑，m；Di為細(xì)胞變形后的當(dāng)量直徑，m；R、r分別為細(xì)胞的直徑和半徑，m；V0、V分別為細(xì)胞初始和變化后體積，ΔV為細(xì)胞體積的變化，m3。

圖4所示為不同冷卻速率下體積與內(nèi)壓的變化。由圖4可知，冷卻過程中，從20 ℃降至4 ℃左右時(shí)，細(xì)胞內(nèi)壓增大；從4 ℃降至0 ℃時(shí)，內(nèi)壓略有減小；0 ℃之后，內(nèi)壓繼續(xù)增大，直至細(xì)胞完全結(jié)晶。而體積的變化與內(nèi)壓變化趨勢相反。當(dāng)溫度高于0 ℃時(shí)，細(xì)胞的體積在4 ℃附近出現(xiàn)最小值，這是因?yàn)樗拿芏仍? ℃時(shí)最小，隨著溫度繼續(xù)降低，水的體積逐漸增大。當(dāng)溫度低于0 ℃時(shí)，細(xì)胞間隙逐漸形成冰晶，擠壓細(xì)胞，并伴隨著細(xì)胞水分外流，導(dǎo)致細(xì)胞體積減小，直到細(xì)胞完全凍結(jié)。

由圖4還可以發(fā)現(xiàn)，復(fù)溫過程與冷卻過程類似，但當(dāng)溫度恢復(fù)至室溫后，細(xì)胞的體積不會(huì)完全恢復(fù)。因此，無論冷卻速率多大，均會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生影響，并且這種影響只能降低，不可避免。該影響與細(xì)胞內(nèi)壓的變化有緊密的聯(lián)系。細(xì)胞內(nèi)壓的變化會(huì)對細(xì)胞形狀產(chǎn)生直接影響。內(nèi)壓增大，體積減小，使其形狀發(fā)生改變，當(dāng)達(dá)到細(xì)胞的屈服極限時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)便會(huì)發(fā)生變化，致使細(xì)胞死亡。而且冷卻速率越慢，這種影響越明顯，與2.1節(jié)的結(jié)論一致。當(dāng)冷卻速率為2 ℃/min時(shí)，冷卻-復(fù)溫過程結(jié)束后，細(xì)胞內(nèi)壓增大了0.388×10-2Pa，體積減小了2.264×10-13m3。

圖4 不同冷卻速率下體積與內(nèi)壓的變化Fig.4 The volume and internal pressure vary with the temperature at different cooling rates

圖5所示為冷卻速率為2 ℃/min時(shí)洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞圖像。對比圖5(a)與(b)可知，復(fù)溫后細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。

圖5 冷卻速率為2 ℃/min時(shí)洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞圖像Fig.5 Pictures of cells in original state and after rewarming at cooling rate of 2 ℃/min

2.3 過冷度與結(jié)晶時(shí)間、細(xì)胞體積變化的關(guān)系

利用低溫顯微鏡對不同冷卻速率下的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞進(jìn)行觀察，得到細(xì)胞結(jié)晶所需時(shí)間與結(jié)晶溫度。結(jié)晶時(shí)間是指從初始狀態(tài)至細(xì)胞完全結(jié)晶的時(shí)間。結(jié)晶溫度為細(xì)胞完全結(jié)晶時(shí)的溫度，將結(jié)晶溫度轉(zhuǎn)換為過冷度[14]，即：

ΔT=Tz-Ti

(5)

為了對比不同冷卻速率對細(xì)胞形變的影響，利用式(6)計(jì)算細(xì)胞的相對體積變化[15-16]：

(6)

式中：ΔT為過冷度，℃；Tz為液體的凝固點(diǎn)，取0 ℃；Ti為細(xì)胞結(jié)晶時(shí)的溫度，℃；VR為細(xì)胞冷卻-復(fù)溫前后的相對體積變化，%。

圖6所示為冷卻速率對過冷度、結(jié)晶時(shí)間、VR的影響。由圖6可知，相對體積變化、結(jié)晶時(shí)間及過冷度在冷卻速率為2～20 ℃/min時(shí)，變化較為劇烈，其中結(jié)晶時(shí)間縮短了86.45%，過冷度增加了7.5 ℃，VR由9.7%減小為3.05%。當(dāng)冷卻速率大于20 ℃/min后，三者的變化趨勢變緩，直至90 ℃/min時(shí)，結(jié)晶時(shí)間縮短了32.89%，過冷度增大了7 ℃，結(jié)晶時(shí)VR由3.05%減小為2.45%。

圖6 冷卻速率對過冷度、結(jié)晶時(shí)間、相對體積變化的影響Fig.6 Effect of cooling rate on supercooling degree, crystallization time, and relative volume change

這是由于細(xì)胞間隙溶液濃度相對較小，當(dāng)冷卻速率較小時(shí)，細(xì)胞間隙處首先發(fā)生結(jié)晶現(xiàn)象，細(xì)胞外溶液濃度增高，細(xì)胞內(nèi)水分發(fā)生遷移至細(xì)胞間隙。細(xì)胞間隙吸收水分的同時(shí)也在進(jìn)行結(jié)晶，并釋放潛熱。而且冷卻速率越慢，流向細(xì)胞間隙的水分越多，細(xì)胞間隙形成的冰晶越大，細(xì)胞結(jié)晶時(shí)的變形量越大，復(fù)溫后細(xì)胞的變形量也越明顯。當(dāng)冷卻至一定溫度時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分的化學(xué)鍵不再穩(wěn)定，瞬間結(jié)晶，釋放潛熱。

當(dāng)冷卻速率較大時(shí)，短時(shí)間提供給細(xì)胞的冷量較多，溫度下降較快，細(xì)胞間隙溶液迅速凍結(jié)，細(xì)胞內(nèi)的水分來不及外流。因此結(jié)晶所需的過冷度較大，在結(jié)晶瞬間釋放大量潛熱。并且細(xì)胞間隙形成的冰晶較小，導(dǎo)致結(jié)晶后細(xì)胞變形量較小。當(dāng)冷卻過程中細(xì)胞的變形量較小時(shí)，恢復(fù)至室溫后，細(xì)胞的變形量也隨之減小。90 ℃/min時(shí)，冷卻-復(fù)溫結(jié)束后，VR僅為1.24%。因此冷卻速率越大，過冷度越大，結(jié)晶時(shí)間越短，對細(xì)胞體積的影響也越小。而此時(shí)細(xì)胞能夠恢復(fù)至初始狀態(tài)的能力較強(qiáng)，最終對細(xì)胞造成的損傷較小。

3 結(jié)論

本文將洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞分別在2、6、8、12、15、20、50、90 ℃/min的冷卻速率下進(jìn)行冷卻-復(fù)溫，對細(xì)胞冷凍過程的變化規(guī)律及冰晶對細(xì)胞的影響進(jìn)行了研究，得出以下結(jié)論：

1)冷卻速率較低時(shí)，細(xì)胞透光能力強(qiáng)。冷卻速率為2 ℃/min時(shí)平均灰度值達(dá)到44.11%，冷卻速率為2～90 ℃/min的平均灰度值下降37.2%。此時(shí)形成的冰晶雖然數(shù)量較少，但體積較大，對細(xì)胞造成的機(jī)械損傷更大。

2)不同冷卻速率下，細(xì)胞體積與內(nèi)壓的變化不同，但整體趨勢相同。細(xì)胞體積隨冷卻溫度的下降，整體呈下降趨勢，復(fù)溫過程細(xì)胞體積變化規(guī)律與冷卻過程相反。但體積變化在4 ℃附近出現(xiàn)突變，這是由于水在4 ℃時(shí)的密度最小。細(xì)胞體積與內(nèi)壓變化趨勢相反。

3)細(xì)胞經(jīng)歷冷卻-復(fù)溫過程后，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形狀發(fā)生了不可逆變化，但在較高的冷卻速率時(shí)其體積變化不明顯。當(dāng)冷卻速率為90 ℃/min時(shí)，相對體積變化量僅為1.24%。

本文受天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(16JCQNJC14000)資助。(The project was supported by the Natural Science Foundation of Tianjin (No.16JCQNJC14000).)