一種蘇云金桿菌商品制劑菌種的分類鑒定

李景壯，曾 娟，聶天瑩，肖 飛，段亞玲

（貴州省分析測試研究院，貴陽 550002）

隨著人們對環境保護要求的提高，微生物農藥成為今后農藥的發展方向之一。蘇云金桿菌是包括許多變種的一類產晶體芽孢桿菌，具有專一性、高效和對人畜安全等優點。目前蘇云金桿菌商品制劑已達100多種，是世界上應用范圍最廣、用量最大、研究最多的微生物殺蟲劑。

由于蘇云金桿菌商品制劑種類繁多、應用廣泛，因此，對市場上蘇云金桿菌商品制劑產品進行分類鑒別尤為重要。本文建立了蘇云金桿菌商品制劑菌株快速分離純化的前處理方法和鑒定方法，為保證我國微生物農藥產品質量，推動微生物農藥的快速發展提供了科學依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 分離材料

以市場上購買的蘇云金桿菌商品制劑（懸浮劑）為試驗材料，4℃保存以確保制劑中微生物的生物活性。

1.2 培養基

形態特征及生理生化特征試驗所用培養基采用細菌培養[1]。

1.3 主要試劑

75%乙醇水溶液、0.1%氯化汞甲醇溶液、牛肉膏、瓊脂條、蛋白胨、NaCl，均為分析純；Tris-HCl緩沖液、核酸染料GoldView、瓊脂糖，北京鼎國生物技術有限公司；EX Taq酶、脫氧核糖核苷三磷酸dNTP、10×EX Taq緩沖液，寶日醫生物技術（北京）有限公司；引物10p primr1、引物10p primr2、DL 2000 DNA Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒，北京新時代生物技術有限責任公司。

1.4 主要試驗儀器

PCR儀，杭州朗基科學儀器有限公司；凝膠成像儀、電泳系統，北京君意東方電泳設備有限公司；恒溫水浴鍋、PRX-250B人工氣候培養箱，上海比郎儀器有限公司；醫用離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；AL204電子天平，梅特勒-托利多公司；S-3400N掃描電鏡，日本HITACHI公司；WP700TL23-K5格蘭仕微波爐。

1.5 方法

1.5.1 分離、純化與保存

制劑商品表面消毒方法按《微生物學實驗手冊》操作[2]。用無菌滴管吸取0.5 mL蘇云金桿菌懸浮劑，放入盛有100 mL無菌水的燒杯中，制得10-1稀釋液，然后按10倍的梯度稀釋到10-6。取不同稀釋倍數的菌懸液0.5 mL滴入平板培養基中，于28～30℃培養箱中混菌培養3～4 d。根據菌落的不同形態，在牛肉膏蛋白胨平板上進一步劃線純化、培養，然后將純化后所得菌落轉入裝有牛肉膏蛋白胨的試管中，進行編號，4℃保存備用[3]。

1.5.2 蘇云金桿菌的形態特征

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第8版）、《微生物分類學》（1999版）、《常用細菌系統鑒定手冊》（2001版）的方法，對蘇云金桿菌進行形態學及生理生化特征鑒定。

1.5.3 菌株基因組DNA的提取及PCR反應條件

細菌菌株基因組DNA的提取：采用北京新時代生物技術有限責任公司細菌基因組DNA提取試劑盒提取。

擴增引物：采用擴增細菌16S rDNA的通用引物27F/1492R[4]，由北京新時代生物技術有限責任公司合成，引物具體信息見表1。PCR反應體系總體積為50 mL，其中包括5.0 mL 10×EX Taq緩沖液、4.0 mL dNTP Mix（2.5 mM）、2.0 mL引物10p primr 1、2.0 mL引物10p primr 2、0.5 mL EX Taq酶（5u 2.0 mL模板Template）、36.5 mL無菌超純水。

表1 引物序列

1.5.4 PCR產物電泳檢測

稱取0.24 g瓊脂糖加入至30 mL 0.5×TBE緩沖液，用質量分數0.8%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增產物。每孔點5 mL樣品（3 mL PCR產物＋2 mL loading緩沖液），預留1個孔加入3 mLDL2000 DNAMarker，在80 V恒壓下電泳50 min，電泳結束后將其放在凝膠成像系統下觀察并照相。

1.5.5 切膠純化、測序

將PCR產物純化后送至北京三博遠志生物技術有限責任公司測序。獲得的序列去除載體序列后，進行BLAST比對，結合形態學特征，確定菌株的類別。

1.5.6 DNA序列分析及發育樹的構建

將測序獲得的16S rDNA序列先提交到NCBI中，在GenBank中獲得注冊號，然后通過BLAST進行序列比對。根據同源性相似度差異，選取同源性較高的模式菌株，用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，對分離菌株與數據庫中登錄的近源菌株系統發育關系進行分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離及生理生化特性鑒定

采用稀釋法，根據菌落在牛肉膏蛋白胨培養基平板上的形態特征，經過多次劃線分離純化，得到純化菌株，編號為D。

在顯微鏡下觀察菌株D，其營養體細胞為桿狀，較為粗壯，單生或雙聯體，并以雙聯體為單位連成短桿狀。菌體運動活躍，形成芽孢和伴孢晶體。芽孢呈橢圓形，孢囊不膨大。伴孢晶體呈菱形、近圓形、方形、三角形或不規則形狀，晶體大小不均。該菌落在牛肉膏蛋白胨、葡萄糖瓊脂平板上擴展較快。菌株D電鏡掃描圖像如圖1所示。

圖1 菌株D的電鏡掃描照片

菌株D的菌落外觀為圓形，呈淡黃色透明狀，表面濕潤黏稠，邊緣不規則，略有隆起。菌株D的菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性，有芽孢、鞭毛。菌株D的生理生化測定結果見表2。

表2 菌株D的生理生化特征

2.2 基于16S rDNA基因序列的系統發育分析和分子鑒定

通過BLAST比對后，與NCBI數據庫中已收錄的同源性較高的菌株進行核苷酸同源性比較。菌株D構建發育樹所用各個物種16S rDNA的GenBank序列注冊號見表3，構建的系統發育進化樹見圖2。

表3 菌株D構建發育樹所用16S rDNA序列的注冊號

從表3中可以看出：菌株D與Bacillus thuringiensis、Bacillus cereus、Bacillus sp.、Bacillus wiedmannii、Bacillus aryabhattai、Bacillus proteolyticus、Bacillus subtilis的相似性均為100%。從圖2發育樹中可以看出：菌株D的16S rDNA序列與芽胞桿菌屬Bacillus中的Bacilluscereus strain（GenBank登錄號為CP026678）在同一個分支上，親緣關系最近，序列相似性為100%。

圖2 基于16S rDNA序列菌株D的系統發育樹

3 結論

本文建立了蘇云金桿菌懸浮劑樣品的前處理及菌種鑒定方法。該方法能夠快速、簡便、準確地對蘇云金桿菌商品制劑的菌種進行鑒別，滿足試驗要求。根據菌株形態、生理生化特征及16S rDNA分析結果，該蘇云金桿菌懸浮劑中菌株D為蠟質芽孢桿菌菌株（Bacillus cereus strain），而非蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis strain）。