液相色譜串聯質譜法同時檢測蔬菜中28種農藥殘留

楊玉平，涂林，金嬋，覃娟，李文博，唐婧苗，謝柏艷

（武漢藥品醫療器械檢驗所，湖北武漢430075）

農藥廣泛應用于農業生產，它在防治病蟲害等方面發揮著顯著的作用，但在實際操作過程中，由于農藥產品的質量和管理力度問題，導致不科學、不合理使用農藥的情況時有發生[1]，隨著社會經濟的發展和人們生活水平的不斷提高，人們越來越重視食用農產品的安全衛生，因此蔬菜樣品中農藥殘留問題也越來越引起人們的關注。農藥殘留的監督和檢測體系是加強農藥管理的重要環節，因此建立一個準確、快速、方便可行的檢測方法尤為重要[2]。

農藥多殘留分析方法一般采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）[3]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[4-5]、氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）[6]、液相色譜-質譜聯用法（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）[7-8]等。但是由于需要檢測的農藥種類和組分繁多，以及樣品中多殘留共存的現象突出，使得單一的檢測方法很難滿足所有多殘留樣品的檢測要求，有效應用聯用技術和儀器，是解決以上問題的根本方法[9]。而且，歐盟委員會2002/657/EC決議中規定[10]：對于禁用農藥的陽性結果必須經過質譜確認，以保證定性、定量檢測的可靠性，降低假陽性率。LC-MS/MS能夠區分或消除復雜基質中的其他物質的干擾，靈敏度高，分析速度快，所以被認為是分析復雜基質中農藥殘留最準確可靠的技術[11-13]。

本文旨在研究建立一種高效、適用性強的HPLC/MS/MS檢測方法，同時檢測蔬菜中不同種類、性質差異較大的28種農藥，研究方法的加標回收率、精密度、檢出限、線性范圍、基質適用性等。結合參考文獻[14-17]及國家食藥監總局定期公布的食用農產品監督抽查結果分析，有針對性的選取了克百威、氧化樂果、多菌靈、啶蟲脒等28種毒性較強、檢出率較高的農藥并且用建立的分析方法對來自不同集貿市場的500批蔬菜樣品進行了定量定性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔬菜樣品來自各個集貿市場，蔬菜品種涉及青椒、白菜、西紅柿、黃瓜、花椰菜、芹菜、豆角、蔥、蒜、韭菜、土豆等常見品種。

甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷均為液相色譜級：Fisher chemical；甲酸、乙酸銨均為分析純：國藥集團；氯化鈉（分析純）：國藥集團，用前在140℃烘烤4 h；無水硫酸鈉（分析純）：國藥集團，用前在650℃灼燒1 h，貯于干燥器中，冷卻后備用；NH2固相萃取柱（500 mg/6 mL）：天津博納艾杰爾公司；異丙威、甲萘威、抗蚜威、多菌靈、殘殺威、甲拌磷、毒死蜱、甲胺磷、嘧霉胺、仲丁威、克百威、樂果、滅線磷、乙拌磷、倍硫磷、乙硫磷、馬拉硫磷、丙溴磷、敵敵畏、涕滅威砜、速滅威、殺螟硫磷、腐霉利、亞胺硫磷、氧樂果、啶蟲脒：農業部環境保護科研監測所，質量濃度為100 μg/mL；阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽：農業部環境質量監督檢驗測試中心，阿維菌素質量濃度為100 μg/mL，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽為固體對照。

1.2 儀器與設備

API4000高效液相色譜-串聯質譜儀：美國ABSciex公司；T25高速組織勻漿儀：德國IKA；HY-5調速多用振蕩器：常州國華電器有限公司；L530離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；ASE-12固相萃取儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；N-EVAP112氮吹儀：美國OA。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取與凈化

蔬菜樣品取可食部分切碎、混勻。稱取混勻的樣品20 g（精確至0.01 g）于具塞錐形瓶中，加40 mL乙腈，用高速組織勻漿機在15 000 r/min勻漿提取1 min，加入約5 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，再3 000 r/min離心5 min，吸取上層溶液過無水硫酸鈉后，精密量取10 mL于45℃水浴減壓濃縮近干；用1 mL淋洗液（丙酮∶二氯甲烷=1∶1）洗滌平底燒瓶3次，并分別把洗滌液轉移到活化好的NH2柱上，當液面到達固相萃取（solid phase extraction，SPE）柱篩板表面后，再加入淋洗液22 mL，收集全部淋洗液，于45℃水浴減壓濃縮近干，氮氣吹干，用10 mL甲醇準確定容,用0.22 μm濾膜濾過，上清液供液相色譜-串聯質譜測定。

1.3.2 標準溶液的配制

28種農藥標準溶液用甲醇配制成10 μg/mL的單標儲備液，置于-18℃冰箱中保存。使用時用甲醇稀釋成適當濃度的混合標準工作溶液。

基質匹配標準溶液：用空白樣品基質提取液將混合標準溶液配制啶蟲脒為 7.5、15、30、45、60、75、150、225、300 ng/mL，其他農藥為 5、10、20、30、40、60、100、15、200 ng/mL系列基質匹配標準工作液，基質匹配標準溶液需現用現配。

1.3.3 色譜與質譜條件

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A為0.005 mol/L乙酸銨+0.05%甲酸水溶液；B為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 28種農藥的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures for 28 pesticides

1.3.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；掃描方式：正離子掃描；監測方式：多反應監測；噴霧電壓：5 500 V；去溶劑溫度：500 ℃；氣簾氣：275.8 kPa；霧化氣：344.75 kPa；輔助加熱氣：344.75 kPa；定性離子對、定量離子對、去簇電壓及碰撞氣能量見表2。

2 結果與討論

2.1 提取條件的優化

蔬菜樣品基質差異較大，而且色素含量較多，選取合適的提取溶劑，有利于后續凈化過程的操作。本試驗對比了乙酸乙酯、丙酮、乙腈3種提取溶劑，以乙酸乙酯提取，部分農藥回收率較低；以丙酮和乙腈提取時均能得到較好的回收率，但丙酮提取液水分較多，溶液顏色較深，對后續凈化過程的要求較高。而乙腈對大多數農藥有較好的溶解性，提取液在加入NaCl充分振搖后離心可以與水相充分分離，而且對環境污染和人體危害較小，因此選取乙腈作為提取溶劑。

表2 28種農藥的保留時間和質譜分析參數Table 2 Retention times and mass spectrometric analysis parameters for 28 pesticides

2.2 凈化條件的優化

SPE是一種經典的凈化方式，具有節省溶劑、經濟、高效等特點，因此本文選取SPE作為凈化方法。固相萃取柱常用的填料有石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、NH2和 C18等。GCB 對色素有強烈的吸附效果，NH2具有極性固定相和弱陰離子交換劑，可通過弱陰離子交換或極性吸附達到保留作用，因此具有雙重作用，C18多用于去除脂肪等非極性雜質[18]。研究表明，GCB在吸附色素的同時，會導致含有平面結構的農藥如多菌靈、氟蟲腈等回收率急劇降低[19-20]，因此，參考國家標準GB/T 20769-2008《水果和蔬菜中450種農藥及相關化學品殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》中前處理方法采用NH2凈化柱[21]，含有平面結構的農藥回收率滿足國家標準要求，因此本試驗選取NH2固相萃取柱做為凈化柱。

2.3 色譜條件優化

液相流動相的組成不僅會影響到目標化合物的保留時間和峰形，還會影響到離子化效率，從而影響檢測靈敏度。本方法比較了乙腈-水（V+V）、乙腈-0.1%甲酸水溶液（V+V）、乙腈-0.005 mol/L乙酸銨+0.05%甲酸水溶液（V+V）3種流動相，結果表明在酸性條件下不僅可以提高目標物的離子化程度，還可以改善峰形，因此選取加入甲酸的流動相。進一步比較乙腈-0.1%甲酸水溶液（V+V）、乙腈-0.005 mol/L乙酸銨+0.05%甲酸水溶液（V+V）這兩種流動相，結果表明后者為流動相時，各目標物峰型較好，響應較高，綜合考慮后決定選取乙腈-0.005 mol/L乙酸銨+0.05%甲酸水溶液（V+V）為流動相。通過不斷摸索色譜柱梯度洗脫程序，使得28種農藥在30分鐘內得到很好的分離。圖1為空白基質樣品中添加20 μg/kg農藥的提取離子色譜圖。

圖1 空白樣品基質中添加20 μg/kg農藥的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of a blank spiked with28 pesticides at 20 μg/kg

2.4 質譜條件優化

首先在電噴霧離子源正離子模式下，先對28種農藥的單標溶液進行全掃描，獲得穩定的母離子，選取[M+H]母離子進行二級碰撞，每個化合物至少選取兩對離子進行測定，一對離子作為定量離子，一對離子作為定性離子[19]。本研究對28種目標農藥的分析條件進行了優化，包括選取合適的特征離子對和優化去簇電壓和碰撞能量等參數，最終確立了1.3.3.2的質譜條件。

2.5 方法學驗證

2.5.1 方法的線性范圍和檢出限、定量限

由于食品樣本基質背景復雜，在前處理凈化后并不能完全去除雜質的干擾，樣品共流出物的存在對目標化合物的離子化效率產生很大的影響，基質效應成為影響分析結果的準確度與精密度的關鍵因素[22]，消除和補償分析中帶來的基質效應，常采用基質匹配標準溶液[23-25]。本研究采用空白基質匹配標準溶液外標法進行校準定量。

配制好的基質匹配標準溶液，按照優化好的色譜和質譜條件進行測定，以目標物的質量濃度X（ng/mL）為橫坐標，以定量離子對的峰面積Y為縱坐標，繪制基質標準曲線。分別以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10），確定方法的檢出限和定量限。28種農藥的回歸方程、線性范圍、相關系數和定量限見表3。

表3 28種農藥的線性范圍、回歸方程、定量限、加標回收率和相對標準偏差Table 3 The linear ranges，regression equations，limits of quantitation，recoveries and relative stardard deviations of 28 pesticides

由表3可見，本方法檢出限低、靈敏度高、相關性好，適用于28種農藥的定量分析。

2.5.2 方法的回收率和精密度

本方法采用陰性蔬菜樣品的加標試驗來進行準確度和精密度評價，啶蟲脒在 30、60、150 μg/kg 3 個添加水平，其他農藥在 20、40、100 μg/kg 3 個添加水平，每個水平重復6次，測得平均回收率為63.9%～120.4%，相對標準偏差為2.4%～9.8%，結果見表3。從表3可以看出，本方法的準確度和精密度均能滿足目標化合物的實驗室監測要求。

2.5.3 實際樣品的檢測

采用本文建立的方法對來自各個不同集貿市場的約50批樣品進行檢測，品種涉及青椒、白菜、西紅柿、黃瓜、花椰菜、芹菜、豆角，大蔥、大蒜、土豆等常見品種。對50批樣品分析結果發現，多菌靈、啶蟲脒的檢出率較高，檢出率約5%，根據GB 2763-2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》規定，多菌靈、啶蟲脒的檢出量均在農藥最大殘留量的允許范圍內，符合國家標準規定，其他農藥的檢出率較低。對檢測出的農藥根據歐盟委員會2002/657/EC決議進行了定性確證，結果表明本方法適合同時分析不同蔬菜品種中28種農藥殘留，基質干擾較小，能夠滿足實驗室日常檢測任務需要。

3 結論

通過對方法的提取溶劑、凈化條件、色譜、質譜等條件的優化，建立了一種采用乙腈提取，SPE凈化，同時檢測不同蔬菜品種中28種農藥殘留的高效液相色譜-串聯質譜方法，該方法具有應用范圍廣、靈敏度高等特點，實現了28種農藥殘留的同時快速檢測，檢出限、定量限均符合國家標準，重現性好、穩定性優，基質適用性好，可應用于實驗室的日常檢測工作。