白藜蘆醇抗疲勞作用及其機理研究

（河南工業大學體育學院，河南鄭州450001）

疲勞是涉及許多生理和生化作用的一種機體復雜綜合癥狀，也是腦力或體力活動達到一定強度時必須發生的機體生理保護現象[1]。疲勞不僅使機體工作能力暫時下降，而且還是機體處于亞健康狀態或發展成疾病狀態的前兆，表明機體的健康即將或已經受到損害。根據癥狀表現不同，疲勞可分為體力和腦力疲勞。體力疲勞（也稱外周疲勞）主要表現為運動能力下降，機體不能維持預定的運動強度。腦力疲勞主要表現為意志和行為的負面變化，如精神失常、健忘、失眠、抑郁、頭暈等。體力疲勞是影響機體健康的重要因素之一，長期持續體力疲勞可能會導致機體過早衰老、患腫瘤、心腦血管等疾病風險增高[2]。在過去的幾十年里，研究人員對體力疲勞的機理進行了眾多研究，并提出了各種理論，如阻塞理論、能源物質耗竭理論、內環境穩定性失調理論、保護抑制理論、突變理論、自由基理論等[3]，其中，自由基理論最受關注。自由基能引起線粒體呼吸鏈產生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）過程受損，使細胞能量合成發生障礙，影響肌纖維收縮功能；另外，運動時機體代謝增強，耗氧量增加，導致機體各組織中產生過多的自由基與活性氧（reactive oxy gen species，ROS），這可能超過機體自身抗氧化防御系統（酶與非酶）的清除能力，產生氧化應激。過量的自由基與ROS可以攻擊脂質、蛋白質、DNA等細胞大分子，從而使正常的細胞功能惡化，出現組織損傷、肌肉收縮能力下降等現象而產生疲勞[4]。近年來的研究已證實，外源性抗氧化劑可通過抑制或阻止細胞內可氧化底物的氧化、抑制脂質過氧化反應、直接清除自由基或與內源性抗氧化劑形成協同抗氧化網絡來降低氧化應激，延遲體力疲勞[5]。因此，對機體補充外源性抗氧化劑是延緩體力疲勞的一種行之有效的方法。近些年，一些多糖、皂苷、黃酮類化合物、小分子肽類等天然抗氧化活性成分已被發現具有顯著的抗疲勞作用[3，6-7]。

白藜蘆醇（3，4'，5-三羥基芪，resveratrol）為二苯乙烯類的多酚類化合物，是植物面對病原體感染和各種自然惡劣條件下而產生的一種天然植物化學物質。目前白藜蘆醇已在葡萄、花生、部分漿果及草藥等70多種植物中被發現，其中葡萄皮中含量最高，可達50 mg/kg～100 mg/kg[8]。現代藥理學研究證實，白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗衰老、抗病毒、保護肝與腎及免疫調節作用[9]。此外，白藜蘆醇在體內、體外均表現出強烈的抗氧化活性，能有效的清除各類自由基，抑制脂質過氧化反應[10-11]。鑒于白藜蘆醇的強抗氧化性，可以推測白藜蘆醇有可能與機體內源性抗氧化酶協同作用，清除劇烈運動產生的過量自由基、降低氧化應激而發揮抗疲勞作用。因此，本研究采用力竭訓練動物模型，在預實驗基礎上，分別灌胃不同劑量白藜蘆醇，測定其抗疲勞效果，并從不同角度入手，探尋其抗疲勞可能的機制，這將為白藜蘆醇在運動營養領域的應用及開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 化學品與試劑

白藜蘆醇（純度99%）：北京萊耀生物科技有限公司；血乳酸（blood lactic acid，BLA）測定試劑盒：北京雷根生物技術有限公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測定試劑盒：中生北控生物科技有限公司；肝、肌糖原測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒：南京建城生物技術研究所；試驗中所使用的其他化學品均為分析純，試劑的配制采用雙蒸水。

1.1.2 主要儀器

ZH-PT型動物實驗跑臺：安徽正華生物儀器設備公司；UV5型分光光度計：瑞士梅特勒-托利多公司；HH-501型水浴鍋：江蘇省金壇市友聯儀器研究所；5424R臺式離心機：德國Eppendorf公司；ELx808型酶標儀：美國Biotek公司；QL-901型旋渦混合器：海門市麒麟醫用儀器廠。

1.1.3 實驗動物

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（體重180 g～200 g）：河南省實驗動物中心提供。動物分籠飼養于標準化飼養室，保持12 h的晝夜循環，室內溫度控制在（22±2）℃，濕度控制在（50±5）%；動物自由攝取標準飼料與水。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與治療

經過7 d適應環境后，將大鼠按體重隨機分為4組，每組8只，分別是低劑量白藜蘆醇組（low-dose resveratrol treatment group，L-ReG）、中劑量白藜蘆醇組（medium-dose resveratrol treatment group，M-ReG）、高劑量白藜蘆醇組（high dose resveratrol treatment group，H-ReG）、空白對照組（control group，CG）。3個白藜蘆醇組分別接受25、50、100 mg/kg·bw劑量的白藜蘆醇灌胃治療（劑量選擇來自于預實驗，白藜蘆醇溶于1.0 mL蒸餾水中制成懸浮液），空白對照組接受等劑量蒸餾水，每天一次，連續4周。所有的動物實驗操作均嚴格依照《國務院實驗動物管理條例》以及《河南省實驗動物管理辦法》中的相關規定進行，并被河南工業大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2.2 大鼠跑步運動

大鼠跑步運動包括適應性訓練、強化訓練及力竭實驗。第1周進行適應性訓練，藥物灌胃30 min后，將大鼠放在實驗跑臺上（跑道規格為1 000 mm×90 mm×120 mm）進行跑步20 min訓練（坡度傾角設置為0°，速度15 m/min）；第2～4周進行強化訓練，藥物灌胃30 min后，將大鼠放在實驗跑臺上進行跑步20 min訓練（坡度傾角設置為0°，速度30 m/min）；第4周最后一天（第28天），藥物灌胃30 min后，將大鼠放在實驗跑臺上進行力竭跑步實驗，坡度傾角設置為10°，以速度30 m/min跑步至力竭。力竭被定義為大鼠不能繼續跑動，呼吸急促、俯臥垂頭、滯留跑道后端，經電刺激后仍無效，且抓起大鼠時無掙扎動作[12]。記錄力竭跑步時間。

1.2.3 疲勞相關生化指標測定

力竭跑步結束后，將大鼠在乙醚麻醉后剖開腹腔，腹主動脈取血，儲存在-80℃用于分析BLA與BUN；然后快速切除肝臟與股四頭肌，用預冷生理鹽水漂洗后濾紙吸干，然后儲存在-80℃用于測定肝、肌糖原含量以及肝組織中SOD、GPx、CAT、MDA的含量。所有生化指標測定均按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 統計學分析

測定結果用mean±SD表示，數據處理采用SPSS軟件進行過單因素方差（ANOVA）分析，組間比較用Post Hoc檢驗，p＜0.05被認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇對大鼠力竭跑步時間的影響

在運動過程中，耐力增強代表著疲勞感降低，因此判定藥物抗疲勞作用最直接指標是運動耐力的強弱[13]。動物力竭跑步運動一種實驗性運動模型，很適合評價機體運動耐力，并具有良好的重現性，力竭時間的長短能夠客觀反映藥物抗疲勞能力[14]。白藜蘆醇對大鼠力竭跑步時間的影響見圖1。

由圖1可以看出，與空白對照組（CG）組相比，3個不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）力竭跑步時間均顯著增加（p＜0.05），增加率分別為13.59%、25.60%、34.73%。這表明，白藜蘆醇能延長大鼠力竭跑步時間，增強運動耐力，具有抗疲勞作用。

圖1 白藜蘆醇對大鼠力竭跑步時間的影響Fig.1 Effects of resveratrol on the exhausted running time of rats

2.2 白藜蘆醇對運動后大鼠血乳酸的影響

糖酵解是劇烈運動的主要能量來源。當肌肉從無氧酵解中獲得足夠能量時，會產生相當數量乳酸（碳水化合物的糖酵解產物）；乳酸濃度的增加會降低肌肉和血液中pH值，從而引起各種生理和生化副作用而產生疲勞。減少乳酸的堆積或快速清除乳酸有利于緩解體力疲勞[15]。因此，BLA是體力疲勞的敏感指標之一。白藜蘆醇對運動后大鼠血乳酸的影響見圖2。

圖2 白藜蘆醇對運動后大鼠血乳酸的影響Fig.2 Effects of resveratrol on the blood lactic acid of rats

由圖2可以看出，與空白對照組（CG）組相比，3個不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）BLA含量顯著降低（p＜0.05），降低率分別為 15.82%、19.42%、34.58%。這說明，白藜蘆醇能減少運動后乳酸的堆積或快速清除乳酸，從而緩解疲勞。

2.3 白藜蘆醇對運動后大鼠血尿素氮的影響

尿素氮是蛋白質和氨基酸的代謝產物。尿素在肝臟中形成，是蛋白質代謝的終產物，由血液攜帶到腎臟排泄[16]。當碳水化合物和脂肪分解代謝所產能量無法滿足機體需要時，蛋白質和氨基酸就開始分解代謝以滿足能量需求。BUN含量增加會反映出蛋白質和氨基酸的分解加劇，這會破壞肌肉收縮力并最終導致體力疲勞。BUN和運動耐力之間存在負相關，即機體能夠適應運動耐力程度越低，BUN增加就越顯著[17]。因此，BUN是體力疲勞的另一敏感指標。白藜蘆醇對運動后大鼠血尿素氮的影響見圖3。

圖3 白藜蘆醇對運動后大鼠血尿素氮的影響Fig.3 Effects of resveratrol on the blood urea nitrogen of rats

由圖3可以看出，與空白對照組（CG）組相比，中、高劑量白藜蘆醇組（M-ReG、H-ReG）BUN含量顯著降低（p＜0.05），降低率分別為 14.98%、24.14%；低劑量白藜蘆醇組（L-ReG）BUN含量雖然也輕微降低，但沒有統計學意義（p＞0.05）。這說明，白藜蘆醇能減少BUN的積累，降低蛋白質代謝而緩解疲勞。

2.4 白藜蘆醇對運動后大鼠肝、肌糖原的影響

運動耐力強弱與能量儲存及供應密切相關。糖原作為能量的重要來源，用于補充運動期間的血糖消耗，并維持血糖穩定在生理范圍內。劇烈運動時，首先肌糖原被耗盡，接著肝糖原氧化分解產生葡萄糖來提供血糖；當肝糖原被耗盡時會發生體力疲勞[18]。增加糖原的儲存或減少糖原的消耗可提高運動耐力，延遲疲勞的發生。白藜蘆醇對運動后大鼠肝、肌糖原的影響見圖4。

圖4 白藜蘆醇對運動后大鼠肝、肌糖原的影響Fig.4 Effects of resveratrol on the liver and muscular glycogen of rats

由圖4可以看出，與空白對照組（CG）組相比，3個不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）肝、肌糖原含量顯著增加（p＜0.05），肝糖原增加率分別為28.27%、57.24%、69.16%；肌糖原增加率分別為27.58%、37.07%、47.41%。這說明，白藜蘆醇能改善運動代謝控制和能量代謝活化，通過增加肝、肌肉糖原的儲存來改善體力疲勞。

2.5 白藜蘆醇對運動后大鼠肝組織抗氧化酶的影響

劇烈運動造成耗氧量增加，產生大量活性氧（ROS）與自由基，導致體內內源性抗氧化防御系統動態平衡發生紊亂產生氧化應激。過量的ROS與自由基能攻擊細胞膜、蛋白質、脂質、DNA等，造成氧化損傷。此外，ROS不僅能直接影響能量供應和興奮-收縮偶聯過程中的酶活性，而且還加速BLA和SUN的積累[19]。正常情況下，機體有酶和非酶抗氧化劑這兩種主要的內源性防御系統，能減少ROS與自由基的有害作用，降低氧化應激。SOD、GPx、CAT是機體內重要的抗氧化酶。SOD是超氧自由基清除因子，能將O2-·轉化為H2O2；GPx將H2O2或氫過氧化物還原成H2O和醇；CAT能催化H2O2分解成H2O和O2[20]。但這些抗氧化酶在疲勞和其他疾病狀況下會發生減弱現象。白藜蘆醇對運動后大鼠肝組織抗氧化酶的影響見圖5。

圖5 白藜蘆醇對運動后大鼠肝組織抗氧化酶的影響Fig.5 Effects of resveratrol on the antioxidant enzyme in liver of rats

由圖5可以看出，與空白對照組（CG）組相比，3個不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）SOD與GPx含量顯著增加（p＜0.05），SOD增加率分別為22.19%、33.71%、36.55%；GPx增加率分別為12.98%、16.39%、25.60%。中、高劑量白藜蘆醇組（M-ReG、HReG）CAT含量顯著增加（p＜0.05），增加率分別為15.19%、22.88%；低劑量白藜蘆醇組（L-ReG）CAT含量雖然也輕微增加，但沒有統計學意義（p＞0.05）。這說明，白藜蘆醇不僅能作為外源性抗氧化劑直接延緩疲勞，而且還能提高機體內抗氧化酶活性，與內源性抗氧化防御系統形成協同抗氧化網絡來對抗氧化應激，發揮抗疲勞作用。

2.6 白藜蘆醇對運動后大鼠肝組織丙二醛的影響

研究已經證實，劇烈運動產生ROS與自由基會破壞線粒體功能，使其失去作為電子傳遞鏈組分的能力，導致脂質過氧化發生并進一步造成氧化損傷[21]。丙二醛（MDA）是自由基誘導的脂質過氧化主要產物，也是評價運動誘導氧化應激最敏感的生物標志物之一[22]。白藜蘆醇對運動后大鼠肝組織丙二醛的影響見圖6。

圖6 白藜蘆醇對運動后大鼠肝組織丙二醛的影響Fig.6 Effects of resveratrol on the MDA in liver of rats

由圖6可以看出，與空白對照組（CG）組相比，3個不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）MDA含量顯著降低（p＜0.05），降低率分別為18.21%、24.14%、28.07%。這說明，白藜蘆醇能減少自由基引起的脂質過氧化，保護肝細胞膜完整性并維持肝臟正常生理狀態，進而提高運動耐力，促進疲勞恢復。

3 結論

白藜蘆醇具有抗疲勞作用，其能延長大鼠力竭跑步時間；降低BLA、BUN、肝組織中MDA含量；增加肝糖原、肌糖原以及肝組織中SOD、GPx、CAT含量。白藜蘆醇抗疲勞作用機理其機制可能與以下因素有關：

1）白藜蘆醇能降低代謝產物的堆積或快速清除代謝產物來延緩疲勞。

2）白藜蘆醇能改善運動代謝控制和能量代謝活化，通過增加肝、肌肉糖原的儲存來改善疲勞。

3）白藜蘆醇能提高體內抗氧化酶活性，與內源性抗氧化劑形成協同抗氧化網絡來降低氧化應激，發揮抗疲勞作用。

4）白藜蘆醇能減少自由基引起的脂質過氧化，保護肝細胞膜完整性并維持肝臟正常生理狀態，進而提高運動耐力，促進疲勞恢復。