高鹽稀態(tài)發(fā)酵黑豆醬油工業(yè)化研究

（天津市利民調(diào)料有限公司，天津300308）

黑豆，又稱烏豆，是大豆的一種，是我國傳統(tǒng)的醫(yī)食兩用食品，是植物中營養(yǎng)比較豐富的保健佳品。黑豆?fàn)I養(yǎng)豐富，具有高蛋白、低熱量的特性，每百克含蛋白質(zhì)36.1 g、脂肪15.9 g、膳食纖維10.2 g、碳水化合物23.3 g、鈣 224 mg、鎂 243 mg、鉀 1 377 mg、磷 500 mg，還含有人體必需的VB1、VB2、VC、煙酸和微量元素鐵、錳、鋅、銅、鉬、硒等，其中蛋白質(zhì)含量高的可達(dá)48%以上，居豆類之首，素有“植物蛋白之王”的美譽(yù)[1-2]。黑豆蛋白質(zhì)中的氨基酸組成結(jié)構(gòu)也優(yōu)于黃豆，不僅含有人體必需的8種必需氨基酸，其比例也符合人體需要，特別是黑豆中的賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸含量與黃豆相比，分別高出 15.5%、15.3%、29%[3-4]。

但是，黑豆在利用方面存在一些弊端。直接食用黑豆有很重的苦澀味，抗?fàn)I養(yǎng)因子未失活，也不能達(dá)到保健的功效。關(guān)于黑豆醬油深加工的研究多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，很少實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。因此，本論文研究高鹽稀態(tài)發(fā)酵黑豆醬油產(chǎn)業(yè)化的可行性，依托公司現(xiàn)有黃豆醬油生產(chǎn)線，進(jìn)行黑豆醬油發(fā)酵嘗試。在米曲霉、酵母菌等微生物的作用下，能將黑豆的保健作用充分發(fā)揮，制作出高品質(zhì)醬油。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆：市售青仁黑豆，黑龍江產(chǎn)區(qū)；福林酚（BR）：北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；三氯乙酸（分析純）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純）、酪氨酸（食品級）：南京化學(xué)試劑股份有限公司；甲醛（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；醬油曲精：濟(jì)寧玉園科技有限公司；硝酸銀（分析純）：天津市南開化工廠；鉻酸鉀（分析純）：天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠；硫酸（分析純）：天津化學(xué)試劑三廠；硼酸（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

SP-752型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；PHSJ-5型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SY201S-1型電熱恒溫干燥箱：天津市三水科學(xué)儀器有限公司；SKD-2000型全自動(dòng)凱氏定氮儀：上海市沛歐分析儀器有限公司；DN3800型玻璃鋼保溫發(fā)酵罐：連云港中復(fù)連眾復(fù)合材料有限公司；SZG型蒸球：江陰市華信藥化設(shè)備有限公司；SFY-25-50-100L三聯(lián)發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江生物設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 指標(biāo)測定

成曲中性蛋白酶活力測定：SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》中福林法；成曲糖化酶活力測定：GB 1886.174-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑食品工業(yè)用酶制劑》中A.3方法；水分測定：GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》中直接干燥法；鹽分、總酸測定：GB/T 5009.40-2003《醬衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》；可溶性無鹽固形物、總氮、氨基酸態(tài)氮、銨鹽測定：GB/T 18186-2000《釀造醬油》；還原糖測定：GB 5009.7-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定》中直接滴定法。

1.2.2 制曲過程檢測

黃豆醬油中黃豆與炒小麥的質(zhì)量比為7∶3，考慮到黑豆蛋白含量偏高，將黑豆與炒小麥質(zhì)量比調(diào)整為6∶4。兩組試驗(yàn)泡發(fā)、蒸煮、接菌量、制曲控制保持一致。黃豆（黑豆）在泡豆槽加入足量水，經(jīng)8 h～12 h泡發(fā)。泡豆完全的標(biāo)準(zhǔn)：表面無褶皺，掰開無白心。

泡好的黃豆（黑豆）進(jìn)入蒸球中蒸煮。蒸煮條件為：0.2 MPa，2 min。正好的條件為：豆子的碾碎壓力為5 000 N～6 000 N。

冷卻后，豆子與炒小麥混合，接種種曲0.3‰。品溫超32℃第一次翻曲，10小時(shí)后第二次翻曲，72小時(shí)后出曲。

取36、72h的曲料樣品，進(jìn)行中性蛋白酶活力測定。

1.2.3 發(fā)酵過程檢測

成曲和19°Be'鹽水（0℃～5℃）混合入罐發(fā)酵，鹽水用量為曲料3倍。發(fā)酵過程中間歇攪拌，品溫28℃時(shí)，加入酵母培養(yǎng)液（≥107cfu/mL），每罐35 L。定期從灌底出油口取樣檢測鹽分、總酸、氨基酸態(tài)氮、可溶固形物、銨鹽等指標(biāo)。當(dāng)樣品氨基酸態(tài)氮含量≥1 g/100 mL時(shí)，醬油成熟。

2 結(jié)果與分析

2.1 成曲質(zhì)量分析

制曲的目的在于使米曲霉充分的生長繁殖，為醬油發(fā)酵分泌積累高活力豐富的酶系。在這些酶中，蛋白酶是最為重要的一種。蛋白酶將豆類中的蛋白質(zhì)降解為多肽和小分子的氨基酸等可溶性含氮物質(zhì)。該過程反應(yīng)越徹底，醬油中的蛋白質(zhì)、氨基酸含量就越高，原料蛋白質(zhì)的利用率也就越高[5-6]。

糖化酶將淀粉質(zhì)原料分解為可利用的葡萄糖，為酵母菌、乳酸菌等微生物提供碳源，是酒精發(fā)酵、乳酸發(fā)酵的基礎(chǔ)物質(zhì)，對醬油的色香味有重大影響[7]。

在制曲24、48、72 h分別取樣，對比試驗(yàn)組和對照組的中性蛋白酶和糖化酶活力。試驗(yàn)結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 試驗(yàn)組和對照組中性蛋白酶活力比較Fig.1 The comparison of neutral protease activity between experimental and control group

圖2 試驗(yàn)組和對照組糖化酶活力比較Fig.2 The comparison of glucoamylase activity between experimental and control group

從圖1、圖2中可以看出，兩組曲料隨著制曲時(shí)間的延長，中性蛋白酶活力和糖化酶活力逐步增長。48小時(shí)后，試驗(yàn)組酶活增長幅度開始明顯高于對照組。這說明，利用黑豆制曲可以得到較高的中性蛋白酶和糖化酶活力。

2.2 發(fā)酵過程檢測

2.2.1 總酸含量的檢測

在醬油發(fā)酵過程中，乳酸菌利用碳源產(chǎn)乳酸，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生一些琥珀酸。醬油中的有機(jī)酸起到調(diào)和口感的作用[8]，在發(fā)酵后期也可作為原料進(jìn)行酯化反應(yīng)。因此，總酸是醬油發(fā)酵過程中很重要的一個(gè)理化指標(biāo)。每10天取樣一次，結(jié)果如圖3。

從圖3中可以看出，兩組樣品的總酸總體上逐步增長。發(fā)酵后期，試驗(yàn)組總酸要略高于對照組。

圖3 試驗(yàn)組和對照組總酸含量比較Fig.3 The comparison of total acid content between experimental and control group

2.2.2 氨基酸態(tài)氮含量的檢測

醬油中氨基酸態(tài)氮含量與氨基酸含量成正比，因此是醬油品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)，也是醬油分級的標(biāo)準(zhǔn)[9]。兩組試驗(yàn)氨基酸態(tài)氮含量變化如圖4。

圖4 試驗(yàn)組和對照組氨基酸態(tài)氮含量比較Fig.4 The comparison of amino acid nitrogen contents between experimental and control group

發(fā)酵初期，原料中大分子的蛋白質(zhì)被分解。所以，初期氨基酸態(tài)氮含量升高較快。發(fā)酵中后期，氨基酸態(tài)氮增長變緩，趨于穩(wěn)定。但從圖4中可以看出，發(fā)酵成熟時(shí)，試驗(yàn)組的氨基酸態(tài)氮含量要高于對照組。

2.2.3 還原糖含量的檢測

醬油中的糖不僅是微生物代謝的底物，又可以為美拉德反應(yīng)提供還原糖。因此，還原糖是影響醬油風(fēng)味和色澤的重要因素。試驗(yàn)組和對照組還原糖含量比較如圖5。

圖5 試驗(yàn)組和對照組還原糖含量比較Fig.5 The comparison of reducing sugar content between experimental and control group

由圖5可知，發(fā)酵初期，淀粉類原料在淀粉酶的作用下被分解，造成還原糖含量急速升高。當(dāng)品溫到達(dá)28℃，加入酵母液后，還原糖會被酵母菌利用[10]，所以，造成了還原糖的大幅度下降。在整個(gè)發(fā)酵過程中，試驗(yàn)組和對照組的還原糖變化趨勢相似，含量相差不大。

2.2.4 全氮含量的檢測

全氮包括未分解的蛋白質(zhì)、多肽等可溶性含氮化合物。全氮代表著醬油發(fā)酵的完全程度。試驗(yàn)組和對照全氮含量比較如圖6。

圖6 試驗(yàn)組和對照全氮含量比較Fig.6 The comparison of total nitrogen content between experimental and control group

由圖6可知，發(fā)酵初期，在蛋白酶等酶的作用下，全氮含量急速升高。隨著酵母菌的加入和其他微生物代謝活力增強(qiáng)，全氮含量趨于穩(wěn)定。雖然試驗(yàn)組和對照組全氮含量變化趨勢相同，但發(fā)酵成熟時(shí)，試驗(yàn)組的全氮含量要高于對照組。

2.2.5 可溶性無鹽固形物含量的檢測

可溶性無鹽固形物主要包括醬油中糖類、有機(jī)酸類、氨基酸等。在不添加添加劑的情況下，可溶性無鹽固形物含量越高，說明醬油的品質(zhì)越高[11]。結(jié)果如圖7。

圖7 試驗(yàn)組和對照無鹽固形物含量比較Fig.7 The comparison of salt free solids content between experimental and control group

由圖7可知，發(fā)酵前期，大分子原料被分解成可溶性小分子物質(zhì)，導(dǎo)致無鹽固形物含量升高。隨著微生物的代謝水平升高，無鹽固形物含量呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài)。但試驗(yàn)組的無鹽固形物要高于對照組。

2.3 成品理化對比

發(fā)酵成熟后，將試驗(yàn)組和對照組分別進(jìn)行壓榨、過濾、滅菌、沉淀。并對最終醬油成品進(jìn)行理化指標(biāo)的比對，結(jié)果見表1。

表1 成品主要指標(biāo)對比Table 1 The comparison of main indexes of the end products g/100 mL

從表1中可以看出，在評價(jià)醬油品質(zhì)最重要的3個(gè)指標(biāo)中，試驗(yàn)組均高于對照組。

3 結(jié)論

該文分別以黑豆、黃豆為原料，通過高鹽稀態(tài)方式進(jìn)行醬油的制作，并對兩者的制曲質(zhì)量、發(fā)酵過程中主要理化指標(biāo)以及成品醬油主要理化指標(biāo)進(jìn)行了對比。結(jié)果表明：制曲72 h，黑豆曲料的中性蛋白酶活力和糖化酶活力均高于黃豆曲料；發(fā)酵過程中各項(xiàng)理化指標(biāo)總體變化趨勢相似，并呈現(xiàn)交替變化。發(fā)酵到達(dá)終點(diǎn)時(shí)，黑豆醬醪的總酸、氨基態(tài)氮、全氮、無鹽固形物等指標(biāo)均高于黃豆醬油，還原糖低于黃豆醬油；成品黑豆醬油的可溶無鹽固形物、氨基酸態(tài)氮、總氮指標(biāo)均高于黃豆醬油。