不同提取方法對藍靛果果渣花色苷提取效率的影響

劉雪可，蘇夢飛，楊寧，王月華，孟龍月，*，張美善

（1.延邊大學工學院，吉林延吉133002；2.延邊大學理學院，吉林延吉133002）

藍靛果是一種具有豐富營養(yǎng)價值的漿果，富含氨基酸和維生素等多種活性物質且具有豐富的紫紅色素等高附加食用、藥用價值，廣泛應用于醫(yī)藥、保健、美容等領域[1]。然而，目前在實際加工過程中利用的是其果汁，殘留的果渣大多被直接廢棄，沒有得到有效的再利用，并且導致了區(qū)域環(huán)境及生態(tài)污染問題。因此，如何合理再利用藍靛果果渣受到了社會上的廣泛關注。

花色苷是一類呈紫紅色的生物類黃酮，由花青素與糖以糖苷鍵結合而成[2-3]，因其獨特的化學結構特征具有保護視力、保護血管、抗癌抗腫瘤等生理功能[4-5]。根據(jù)趙玉紅等[6]和等[7]的研究可知藍靛果果渣含有比果汁更多的花色苷，故從中提取花色苷是解決果渣再資源化問題的一個非常有效的方法。然而，因藍靛果果渣中含有比果汁中更為豐富的纖維素與果膠等物質造成從果渣中提取花色苷的難度增加[8]，故而從其中提取花色苷的工藝研究較少，因此如何使纖維素斷裂，使更多的花色苷得以溶出可以作為判別提取工藝優(yōu)劣的參數(shù)。

目前，傳統(tǒng)的溶劑浸提法、超聲輔助提取、微波輔助提取和酶解法等是提取花色苷的常用工藝[9]。其中傳統(tǒng)的溶劑浸提法主要利用提取液對不同成分溶解度的差異將花色苷從植物組織內溶解出來，但此方法具有耗時長、提取率低的缺陷。在傳統(tǒng)提取方法的基礎上適當升高溫度，可以使花色苷在提取液中的溶解度增大利于提取，但溫度過高則會破壞花色苷的結構[10]。目前，天然產物提取中使用最為普遍的提取工藝是超聲輔助提取，超聲工藝在天然產物提取中的理論基礎主要有3個，即空化作用、熱效應和機械作用。超聲波是一種彈性波，其在介質中產生的機械效應與空化作用使溶劑與物料間產生摩擦與剪應力加劇細胞破裂，促進胞內物質的釋放與擴散，而熱效應又加大了花色苷在溶劑中的溶解度，縮短提取時間，提高效率[6，11]。微波作為一種電離輻射，能使被輻射物質產生撕裂與摩擦而發(fā)熱，且能量傳遞快速均勻，促進成分提取進程，提高產物的提取率，同時微波還具有選擇性好、穿透率強、提取率高、操作時間短等優(yōu)點[12-13]。然而，到目前為止采用不同的提取技術對藍靛果果渣中有效提取花色苷的研究鮮見報道，科研工作者更多的是從藍莓等材料中進行優(yōu)化提取。為此，本文通過選取提取時間作為因素以提取液中花色苷濃度做指標進行試驗，研究傳統(tǒng)的溶劑提取、超聲輔助提取、微波輔助提取的提取效率的高低，旨在為謀求高效快捷的藍靛果果渣中花色苷工業(yè)化生產工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

藍靛果：吉林省汪清縣東北紅豆杉生物科技有限公司。

無水乙醇、鹽酸：天津市科密歐化學試劑有限公司；乙酸鈉、氯化鉀：上海阿拉丁生物科技股份有限公司；乙酸：天津市鼎盛鑫化工有限公司，均為分析純。

循環(huán)水式真空泵（SHB-ⅢA型）：上海豫康科教儀器設備有限公司；電子分析天平（JE1002型）：上海蒲春計量儀器有限公司；磁力攪拌器（HJ-2A型）：金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；超聲清洗機（JP-020型）：深圳市潔盟清洗設備有限公司；家用微波爐（EG7KCGW3-NA型）：九陽股份有限公司；紫外-可見分光光度計（UV-2550型）：島津公司。

1.2 方法

1.2.1 pH試差法的原理

隨pH值的改變花色苷的色調及色度也會改變，但pH值的改變卻不會對干擾雜質的吸光度造成影響。pH 1.0時檢測液中花色苷存在形式為花色苷元離子，此時檢測液的吸光度為花色苷與雜質兩者的吸光度；pH 4.5時檢測液中的花色苷轉化為無色的查爾酮，此時檢測液的吸光度僅為雜質的吸光度。

1.2.2 緩沖溶液的配制

pH 4.5緩沖液的制備：取1.64 g乙酸鈉并使用蒸餾水定容到100 mL，然后通過乙酸調節(jié)pH（4.5±0.1）。

pH 1.0緩沖液的制備：取1.49 g KCl并使用蒸餾水定容為100 mL。精確量取1.7 mL鹽酸之后通過蒸餾水定容到100 mL，配制鹽酸溶液為0.2 moL/L，而后將兩種溶液以25∶67的體積比混合。用HCl溶液調pH（1.0±0.1）。

1.2.3 常溫溶劑浸提中得率隨時間的變化

取2 g果渣與60%乙醇以固液比1∶25（g/mL）混合，常溫下在磁力攪拌器上提取。將浸提液每30分鐘抽濾一次，共抽濾6次。在pH 1.0和pH 4.5的緩沖液中將抽濾后的浸提液稀釋一定倍數(shù)，而后采用UV-2550型紫外-可見分光光度計檢測其在520 nm處的吸光度，不同提取時間下的浸提液中花色苷濃度可由pH試差法[2]計算得出。

1.2.4 加熱溶劑浸提工藝下得率隨時間的變化

將提取溫度升至50℃后，參照常溫溶劑浸提進行花色苷加熱溶劑浸提工藝的提取。

1.2.5 超聲工藝下得率隨時間的變化

取2 g果渣與60%乙醇以固液比1∶25（g/mL）混合，在50℃下超聲輔助提取。從25 min時每5分鐘將提取液抽濾一次，共有6次抽濾。在pH 1.0和pH 4.5的緩沖液中將抽濾后提取液稀釋，而后采用UV-2550型紫外-可見分光光度計掃描檢測其吸光度，不同提取時間下浸提液中花色苷濃度可由pH試差法得出。

1.2.6 微波工藝下得率隨時間的變化

取2 g果渣分為6組與60%乙醇以固液比1∶25（g/mL）混合，50℃下在1分鐘內以10 s的遞增梯度微波輔助提取后抽濾。在pH 1.0和pH 4.5的緩沖液中稀釋將抽濾后提取液，而后采用UV-2550型紫外-可見分光光度計掃描檢測其吸光度，不同提取時間下的提取液中花色苷濃度可由pH試差法得出。

1.2.7 花色苷得率的計算

花色苷含量可依據(jù)FULEKIT等[14]及宋德群等[15]的研究并聯(lián)合比爾定律得出。

式中：An、A1為 pH 1.0、pH 4.5 時花色苷吸光度；V為提取液總體積，mL；n稀釋倍數(shù)；M為矢車菊-3-葡萄糖苷相對分子質量，449；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷消光系數(shù)，29 600；m為樣品的初重，g。

2 結果與分析

2.1 常溫溶劑浸提工藝中得率隨時間的變化

常溫溶劑浸提工藝中花色苷得率隨浸提時間的變化可見圖1。

圖1 常溫溶劑浸提工藝中得率隨時間的變化Fig.1 Variation of yield over time in solvent extraction process at room temperature

由圖1可知，以70%乙醇為提取液、在固液比1∶25（g/mL）的條件下提取花色苷，花色苷得率隨著提取時間的增加也持續(xù)升高，在90 min時達到最高為131.06 mg/100 g。而后繼續(xù)延長提取時間，果渣中花色苷的得率不升反降，原因在于此提取條件下，花色苷在溶劑中的溶解已經(jīng)達到飽和，繼續(xù)增加提取時間，也不能使花色苷得率有明顯的提高，反而會有部分花色苷分解。

2.2 加熱溶劑浸提工藝下得率隨時間的變化

加熱溶劑浸提工藝中花色苷得率隨浸提時間的變化可見圖2。

圖2 加熱溶劑浸提工藝下得率隨時間的變化Fig.2 Variation of yield over time in the heating solvent extraction process

由圖2可知，以70%乙醇為提取液、在固液比為1∶25（g/mL）的條件下，花色苷的得率隨著加熱時間的增加也持續(xù)升高，在90 min時達到最高為134.92 mg/100 g。繼續(xù)延長提取時間，花色苷的得率反而有所下降，原因在于提取90 min后花色苷在溶劑中的溶解已經(jīng)達到飽和，繼續(xù)提取使花色苷在50℃下長時間受熱而部分發(fā)生分解，從而使花色苷得率有所下降，不利于花色苷的提取。

2.3 超聲工藝下得率隨時間的變化

常溫工藝中花色苷得率隨浸提時間的變化可見圖3。

圖3 超聲工藝中得率隨時間的變化Fig.3 Variation of yield over time in ultrasonic process

由圖3可知，以70%乙醇為提取液、在固液比為1∶25（g/mL）的條件下提取花色苷，花色苷得率隨著超聲時間的延長也持續(xù)升高，在35 min時達到一個小高峰，為133.35 mg/100 g，而后繼續(xù)增加提取時間，花色苷得率反而略有少許下降，而后在50 min時又有明顯的上升，為140.23 mg/100 g。超聲輔助提取中由于超聲的空化效應、熱效應及機械作用，會加速花色苷的在溶劑中溶解。但在此過程中超聲時間過短，植物細胞內的花色苷尚不及溶出而使提取量過少；超聲時間過長使花色苷長時間處于高壓受熱狀態(tài)而發(fā)生分解現(xiàn)象，同樣對花色苷提取不利。因此，超聲輔助提取工藝的最佳提取時間為35 min。

2.4 微波工藝下得率隨時間的變化

微波工藝中花色苷得率隨浸提時間的變化可見圖4。

圖4 微波工藝中得率隨時間的變化Fig.4 Variation of yield over time in microwave process

由圖4可知，在以70%乙醇為提取液、固液比為1∶25（g/mL）的條件下，隨著微波時間的延長，花色苷得率也持續(xù)增加，在0.67 min（40 s）時達到最高，為233.4 mg/100 g，繼續(xù)延長微波時間提取液中花色苷得率先降后升，其原因可能為隨著微波時間的增加整個提取體系內的溫度升高過快而使提取液中花色苷的提取速率與花色苷的分解速率不平衡，從而導致在0.67 min后花色苷的含量先降后升，繼續(xù)延長提取時間可能會使體系的溫度過高導致更多的花色苷結構破壞，以致得率降低。因此，在微波輔助提取工藝中的最佳提取時間為0.67 min。

2.5 不同工藝比較

不同浸提工藝下花色苷得率的變化可見圖5。

圖5 不同工藝下花色苷得率比較Fig.5 Comparison of anthocyanin yields under different processes

由圖5可知，在提取液濃度、固液比一定的條件下，4種提取工藝中微波輔助提取的提取效率最好，提取時間最短僅為0.67 min；超聲次之，之后提取效果較好的是加熱溶劑浸提，最后是常溫溶劑浸提。與傳統(tǒng)溶劑提取相比，超聲輔助提取法對果渣和提取劑的機械振動，空化效應和熱效應，有效的破壞了植物細胞細胞壁的結構，在得到的花色苷提取量相同的情況下，超聲輔助提取的時間縮短了兩倍；而與傳統(tǒng)的溶劑提取相比，微波產生的能量在果渣與提取液中傳播快速均勻，體系熱效率高[16]，不僅使提取液中花色苷得率得到極大提高，同時微波輔助提取的時間也由90 min壓縮至0.67 min。

2.6 紫外光譜分析

為了對4種工藝所得花色苷的特征基團進行比較研究，利用UV-2550型紫外-可見分光光度計對4種方法得到的花色苷在240 nm～750 nm范圍內掃描進行紫外光譜分析，結果見圖6。

圖6 4種提取工藝下紫外光譜掃描曲線對比圖Fig.6 Comparison of ultraviolet spectral scanning curvesunder four extraction processes

在紫外區(qū)于270 nm～280 nm和465 nm～550 nm之間有顯著吸收峰的物質基本可視為花色苷類化合物，花色苷類物質可通過檢測提取液的最大吸收波長來判斷，花色苷中酰基的存在及其個數(shù)可由440 nm和300 nm～330 nm處的吸收峰表明[17]。由圖可知4種方法所得到的花色苷無明顯不同。

3 結論

本文通過4種工藝對藍靛果果渣中花色苷類物質進行了有效提取，并對其效率進行比較，結果表明：4種提取工藝中，微波輔助提取的效果最好，最優(yōu)提取時間極短僅為0.67 min，花色苷得率也明顯提高為233.4 mg/100 g；其次是超聲輔助提取，提取時間35 min，花色苷得率為133.35 mg/100 g；之后是加熱溶劑浸提，提取時間90 min，花色苷得率為134.92 mg/100 g；最后是常溫溶劑浸提，提取時間90 min，花色苷得率為131.06 mg/100 g。其中，與傳統(tǒng)的溶劑浸提相比，超聲輔助提取的提取時間縮短了一半，花色苷得率也比之增加；微波輔助提取更是極大地縮短了提取時間，花色苷得率相比溶劑浸提提高了近兩倍。此外，紫外光譜分析表明4種提取工藝所得花色苷基團基本相同。本研究通過對4種常見提取方法最佳提取時間的優(yōu)化驗證了各方法的優(yōu)劣，為科研工作者在藍靛果果渣中花色苷的進一步研究提供理論參考。