稀釋涂布平板法計算公式的推導
——對一道一題多析計算題的透視

甘肅

1. 問題的提出

（節選）如圖1為“土壤中分解尿素的細菌的分離和計數”實驗中樣品稀釋示意圖。據圖分析正確的是（ ）

圖1

C. 5號試管的結果表明每克土壤中的菌株數為1.7×109個

【解析一】5號試管進行稀釋涂布平板法計數的結果表明每克土壤中的菌株數為（168+175+167）÷3×105×10=1.7×108個，C 錯誤。

【解析二】5號試管進行稀釋涂布平板法計數的結果表明每克土壤中的菌株數為（168+175+167）÷3×105×10÷10=1.7×107個，C錯誤。

這是某教輔資料中的一道應用稀釋涂布平板法計數微生物數目的習題，關于C選項的解析存在兩種不同的看法。對比分析，上述解析的分歧有兩方面：一是5號試管的稀釋倍數到底是多少倍？二是根據教材公式計算所得結果到底是每克土壤樣品中的菌株數還是10 g樣品中的菌株數？

2. 從梯度稀釋過程判斷稀釋倍數

應用稀釋涂布平板法統計樣品中活菌數的關鍵是將樣品進行一系列的梯度稀釋，如何進行梯度稀釋？

從人教版教材內容來看，這種稀釋方法就是10倍稀釋法，概括地講：一般固體樣品取10 g，液體樣品取10 mL，以無菌操作法將其加入到裝有90 mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩5～10 min，使微生物細胞分散，靜置20～30 s，即成101倍稀釋液；再用1 mL無菌吸管，吸取101倍稀釋液1 mL移入9 mL無菌水的試管中，吹洗3次，讓菌液混合均勻，即成102倍稀釋液；再換一支無菌吸管吸取102倍稀釋液1 mL移入9 mL無菌水的試管中，即成103倍稀釋液；以此類推，一定要每次更換吸管，連續稀釋，制成 104、105、106、107、108、109等一系列稀釋度菌液，供平板接種使用。

從上述稀釋過程可以看出：（1）固體樣品的101倍稀釋液是按照質量百分比濃度稀釋，其他倍數稀釋液是按照體積比濃度稀釋，而液體樣品的稀釋都是按體積比濃度稀釋；（2）低稀釋倍數的稀釋液體積與無菌水的體積相加即為高稀釋倍數稀釋液總體積；（3）樣品無論是固體樣品還是液體樣品，10 g或10 mL樣品加入90 mL無菌水中，即為將樣品稀釋101倍，將101倍稀釋液的總體積看成100 mL。這樣處理簡單易行，操作方便。

由此可見，如果每次都是稀釋10倍，稀釋n次，則稀釋倍數為10n；如果第一次稀釋100倍，后續稀釋都是10倍，共稀釋n次，則稀釋倍數為10n+1。故上述習題中，5號試管的稀釋倍數為106倍。

3. 結合梯度稀釋過程推導計算公式

結合上述習題中的稀釋過程，分別取5號試管中的稀釋液（即106倍稀釋液）0.1 mL涂布三個平板，計數平均值為C，則10 mL的106倍稀釋液中共有活菌數為（C÷0.1）×10。這些活菌來自1 mL的105倍稀釋液（4號試管），則10 mL的105倍稀釋液中共有活菌數為（C÷0.1）×102。依此類推，100 mL的101倍稀釋液中共有活菌數為（C÷0.1）×107。10 g土壤樣品全在100 mL的101倍稀釋液中，所以每克土壤樣品中的活菌數為（C÷0.1）×107÷10=（C÷0.1）×106。該算式中C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，0.1為涂布平板時所用的稀釋液的體積（mL）（用V表示），106為稀釋倍數（用M表示），即可得到稀釋涂布平板法計算公式：（C÷V）×M。

由此可見，該公式計算結果為每克（或每毫升）樣品中的菌株數。

上述習題106倍稀釋液下平板上生長的平均菌落數C=（168+175+167）÷3=170，V=0.1，M=106，所以5號試管的結果表明每克土壤中的菌株數為1.7×109個，即解析一、二均存在理解誤區。

4. 典型例題

【例1】（2018年，全國卷Ⅰ，第37題節選）（4）甲、乙兩位同學用稀釋涂布平板法測定某一土壤樣品中微生物的數量，在同一稀釋倍數下得到以下結果：

甲同學涂布了3個平板，統計的菌落數分別是110、140和149，取平均值133；

乙同學涂布了3個平板，統計的菌落數分別是27、169和176，取平均值124。

有人認為這兩位同學的結果中，乙同學的結果可信度低，其原因是：________________。

【解析】計數時一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數。乙同學一個平板的計數結果與另兩個相差懸殊，可信度低。

【答案】乙同學的結果中，1個平板的計數結果與另2個相差懸殊，結果的重復性差

【例2】（2016年，四川卷，第10題節選）圖甲是從土壤中篩選產脲酶細菌的過程，圖乙是脲酶基因轉錄的mRNA部分序列（圖乙略）。

（2）在5個細菌培養基平板上，均接種稀釋倍數為105的土壤樣品溶液0.1 mL，培養一段時間后，平板上長出的細菌菌落數分別為13、156、462、178和191。

該過程采取的接種方法是________，每克土壤樣品中的細菌數量為________×108個；與血細胞計數板計數法相比，此計數方法測得的細菌數較________。

【解析】（2）平板上接種稀釋倍數為105的土壤樣品液，該接種方法為稀釋涂布平板法；5個平板上的菌落數分別為13、156、462、178和191，選擇菌落數為30～300的平板進行計數，0.1 mL稀釋倍數為105的培養液含有產脲酶菌的數目為（156+178+191）÷3=175個，則每克土壤樣品中的細菌數量為（175÷0.1）×105=1.75×108個；可能2個或多個產脲酶菌共同形成一個菌落，與血細胞計數板計數法相比，此計數方法測得的細菌數較少。

【答案】（2）稀釋涂布平板法 1.75 少

【例3】（2014年，全國卷Ⅱ，第39題節選）為了調查某河流的水質狀況，某研究小組測定了該河流水樣中的細菌含量，并進行了細菌分離等工作。回答下列問題：

（1）該小組采用稀釋涂布平板法檢測水樣中的細菌含量。在涂布接種前，隨機選取若干滅菌后的空白平板先行培養了一段時間，這樣做的目的是______；然后，將1 mL水樣稀釋100倍，在3個平板上用涂布法分別接入0.1 mL稀釋液；經適當培養后，3個平板上的菌落數分別為39、38和37。據此可得出每升水樣中的活菌數為______。

【解析】（1）為了確定培養基的滅菌是否合格，微生物學實驗一般會隨機選取若干滅菌后的空白平板培養一段時間，觀察培養基上是否有菌落出現；根據題意，C=38，V=0.1，M=100，據此計算出每毫升水樣中的活菌數是3.8×104，再乘以103即可得出每升水樣中的活菌數是3.8×107。

【答案】（1）檢測培養基平板滅菌是否合格3.8×107

5. 結語

在教學過程中，教師應結合人教版教材選修1《生物技術實踐》第23頁：圖2-7樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養流程示意圖引導學生對稀釋和取樣培養過程進行分析，學會判斷稀釋倍數，自主總結出稀釋涂布平板法計算公式。否則，直接將公式告知學生，會使學生不明所以，導致應用公式錯誤頻出的情況。例2題目中的“每克土壤樣品中的細菌數量為________×108個”就是對本文提到的兩種解析的最好回應。當出現這種說法不一的情況時，教師要敢于引導學生質疑，培養學生的批判性思維。

另外，從近幾年高考題對稀釋涂布平板法的考查情況來看，涉及對照實驗設計、結果分析、計數等，如上述例1和例3，其實這些設問方向都是圍繞“使所得估計值更接近實際值”這一核心問題展開的。因此，進行實驗操作和解答題目時應該注意：（1）嚴格按無菌操作進行實驗；（2）隨機選取若干滅菌后的平板先培養一段時間，檢測平板滅菌是否徹底，如果出現菌落，說明滅菌不徹底，需要重新倒平板；或在空白平板上涂布等量的無菌水作為空白對照，以確定培養過程中是否存在雜菌污染現象。如果空白對照組的平板上出現菌落，說明存在雜菌污染現象，需要重新進行實驗；（3）每個稀釋倍數的菌液至少涂布3個平板，設置重復實驗，計算平均值，以減小誤差，提高可信度；（4）注意接種量（V）和培養時間，一般接種0.1 mL稀釋液，接種量過多或時間過長會造成兩個菌落連成一個；（5）選擇菌落數在30～300之間的平板進行計算，計算時應該去掉偏離這個范圍的數據。