脾虛對(duì)哮喘*大鼠脂質(zhì)介質(zhì)合成酶的影響及捏脊法的效應(yīng)研究

★ 熊英 宋志秀 顧云 陸金路 韋姜飛 秦宇航 朱延（.南京中醫(yī)藥大學(xué) 南京003；.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院針?biāo)幗Y(jié)合教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 003）

哮喘是兒童最常見的呼吸道疾病之一，內(nèi)源性的特異性促炎癥消退介質(zhì)（SPMs）調(diào)控障礙被認(rèn)為是哮喘急性炎癥不能及時(shí)消退，并轉(zhuǎn)為慢性炎癥的重要原因［1］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾虛是兒童哮喘的重要病理基礎(chǔ)［2］。筆者前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，脾虛與患有哮喘等過敏性疾病兒童的過敏體質(zhì)密切相關(guān)［3］；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也提示，脾虛導(dǎo)致哮喘大鼠促炎癥消退介質(zhì)水平升高受限，促炎和促炎癥消退介質(zhì)之間平衡紊亂，哮喘炎癥消退減緩等［4-5］。還有研究表明，脾虛使哮喘大鼠肺組織核轉(zhuǎn)錄因子κBp65 （NF-κBp65）的活性進(jìn)一步增加［6］，而 NF-κBp65 活化與哮喘時(shí)多種炎性蛋白的高表達(dá)有關(guān)［7］。

捏脊法是防治兒童哮喘的常用外治法，有較好的臨床效果［8-9］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也顯示，捏脊法可有效改善脾虛哮喘大鼠的腸道菌群失調(diào)，改善促炎和促炎癥消退介質(zhì)之間的失衡，有助于肺部炎癥的消退［4-5］。

環(huán)氧合酶-2（COX-2）、5-脂氧合酶（5-LO）和15-LO 是參與促炎和促炎癥消退介質(zhì)類別轉(zhuǎn)換和合成的關(guān)鍵酶［1］，因而可能在哮喘炎癥的轉(zhuǎn)歸中有著重要作用［10］。因此，本研究欲通過觀察脾虛對(duì)哮喘大鼠COX-2、5-LO、15-LO水平和NF-κBp65活化程度的影響以及捏脊法的干預(yù)作用，以探索脾虛為兒童哮喘重要病理基礎(chǔ)的依據(jù)以及捏脊法的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 雄性SPF級(jí)SD幼鼠42只（體重40.0～50.7g），由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供（許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005）。按照隨機(jī)數(shù)字法，將SD幼鼠分成4組：對(duì)照組（n=6），哮喘組（n=12），脾虛哮喘組（n=12），脾虛哮喘捏脊組（n=12），各組大鼠體重?zé)o明顯差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)室光照適度，潔凈程度及通風(fēng)條件良好，室溫（22℃±2℃），濕度50%～70%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 實(shí)驗(yàn)中所用中藥材由南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂門診部提供，冷水浸泡30min，煎煮2次后將藥液合并，且濃縮至1mL/g的原藥材。卵蛋白（OVA，Grade V，Sigma公司，貨號(hào)A5503），酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），NF-κB p65兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），霧化器（江蘇魚躍器械有限公司），Rayto RT-6100酶標(biāo)分析儀，DP71/BX60型顯微鏡（Olympus Corp.，Tokyo， Japan）。

1.3 脾虛哮喘大鼠模型的建立 以破氣耗氣加饑飽失常方法建立脾虛模型，繼而采用OVA致敏和激發(fā)方法建立哮喘模型［5］，對(duì)照組和哮喘組以自來水灌胃，對(duì)照組以生理鹽水致敏與激發(fā)。

1.4 捏脊法干預(yù) 助手輕輕固定大鼠頭尾部，操作者先以指腹從大椎沿脊柱正中輕撫大鼠背部皮膚至尾根部3遍；再以雙手拇食指輕輕對(duì)稱提起大鼠背部中線兩側(cè)的皮膚，并以指腹相對(duì)用力，緊貼中線從尾根部捏至大椎穴處，共7遍，最后以3遍捏三提一結(jié)束，力量以大鼠不尖叫且較平靜為度。捏脊法干預(yù)在脾虛造模第10天始至OVA致敏前每周一、三、五、日各操作1次，OVA致敏期間每日操作1次。

1.5 ELISA檢測(cè)大鼠肺組織COX-2、5-LO和15-LO水平 右肺葉部分組織剪成小塊分裝于凍存管，投入液氮后儲(chǔ)存于-80℃冰箱儲(chǔ)存待測(cè)。ELISA檢測(cè)嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明進(jìn)行，測(cè)定吸光度值并換算成濃度水平。

1.6 免疫組化檢測(cè)并計(jì)算NF-κBp65細(xì)胞入核的百分比 采用免疫組織化學(xué)SABC（Strept Avidin-Biotin Complex）法檢測(cè)，操作步驟按說明書進(jìn)行。以細(xì)胞核著棕黃色為NF-κBp65入核細(xì)胞，主要觀察肺內(nèi)小支氣管及其周圍部位，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（X400），計(jì)算NF-κBp65入核細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取平均值作為該切片的代表值，以此表示其活性程度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織COX-2、5-LO和15-LO水平 見表1。與對(duì)照組比較，在哮喘造模結(jié)束后18h和42h，哮喘組、脾虛哮喘組和脾虛哮喘捏脊組的COX-2水平均明顯上升（P均＜0.01），且各組42h水平均顯著高于18h時(shí)（P均＜0.01）。脾虛哮喘組18h和42h 的COX-2水平均顯著高于哮喘組（P均＜0.01），而脾虛哮喘捏脊組18h和42h的COX-2水平均顯著低于脾虛哮喘組（P均＜0.01）。

與對(duì)照組比較，在哮喘造模結(jié)束后18h和42h，哮喘組、脾虛哮喘組和脾虛哮喘捏脊組的5-LO水平均明顯上升（P均＜0.01），且各組42h水平均顯著高于18h時(shí)（P均＜0.01）。脾虛哮喘組18h和42h的5-LO水平與哮喘組均無明顯差異（P均＞0.05），而脾虛哮喘捏脊組18h和42h的5-LO水平也與脾虛哮喘組無明顯差異（P均＞0.05），18h時(shí)卻明顯高于哮喘組（P＜0.05）。

與對(duì)照組比較，在哮喘造模結(jié)束后18h和42h，哮喘組、脾虛哮喘組和脾虛哮喘捏脊組的15-LO水平均明顯上升（P均＜0.01），且各組42h水平均顯著高于18h時(shí)（P均＜0.01）。脾虛哮喘組18h的15-LO水平與哮喘組無明顯差異（P＞0.05），但42h已顯著低于哮喘組42h的水平（P＜0.01），而脾虛哮喘捏脊組18h和42h的15-LO水平均顯著高于脾虛哮喘組（P均＜0.01），且明顯高于哮喘組（P均＜0.01）。

表1 各組肺組織脂質(zhì)介質(zhì)合成酶的水平比較（） pg/mL

表1 各組肺組織脂質(zhì)介質(zhì)合成酶的水平比較（） pg/mL

注：與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與哮喘組（18h）比較，▼▼P＜0.01；與脾虛哮喘組（18h）比較，＊＊P＜0.01；與哮喘組（42h）比較，☆☆P＜0.01，☆P＜0.05；與脾虛哮喘組（42h）比較，★★P＜0.01，★P＜0.05；與捏脊脾虛哮喘組（18h）比較，◇◇P＜0.01。

組別 n COX-2 5-LO 15-LO正常對(duì)照組 18h 6 129.00±6.74 861.47±100.58 625.18±41.06哮喘組18h 6 196.01±10.77△△ 1300.48±63.57△△ 685.67±16.98△△42h 6 233.00±15.18△△▼▼ 1946.60±115.62△△▼▼ 817.50±31.49△△▼▼脾虛哮喘組18h 6 244.29±16.65△△▼▼ 1376.91±75.65△△ 674.16±35.66△△42h 6 270.09±20.38△△＊＊☆☆ 2016.54±226.00△△＊＊ 762.58±26.16△△☆☆＊＊脾虛哮喘捏脊組18h 6 218.32±13.73△△▼＊＊ 1496.84±239.74△△▼ 780.35±31.03△△▼▼＊＊42h 6 244.25±20.78△△★★◇◇ 2026.52±148.58△△◇◇ 870.71±17.01△△☆☆★★◇◇

2.2 免疫組化測(cè)定肺組織NF-κBp65的活性 見圖1。NF-κBp65進(jìn)入細(xì)胞核是其被激活的表現(xiàn)，NF-κBp65入核的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例為其活性程度。免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各組NF-κBp65活性均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。

哮喘組和脾虛哮喘捏脊組42h的NF-κBp65活性均比18h明顯降低（P均＜0.05），但脾虛哮喘組42h與18h并無顯著差異（P＞0.05）。脾虛哮喘組42h的NF-κBp65活性顯著高于哮喘組42h時(shí)水平（P＜0.05），脾虛哮喘捏脊組18h和42h的NF-κBp65活性均顯著低于脾虛哮喘組（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 肺組織NF-κBp65的活性比較

3 討論

ω-6長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（PUFAs）為必需脂肪酸，其中的花生四烯酸（AA）一方面可通過5-LO合成半胱氨酸白三烯（CysLTs），或者通過5-LO與15-LO/12-LO的共同作用合成脂氧素（LXs）；另一方面也可通過COX-2合成包括前列腺素 E2（PGE2）在內(nèi)的 PGs［11］。在炎癥消退時(shí)的脂質(zhì)介質(zhì)類別轉(zhuǎn)換過程中，COX-2途徑的PGs在較低水平時(shí)即可啟動(dòng)從5-LO活性占優(yōu)勢(shì)向15-LO活性占優(yōu)勢(shì)的轉(zhuǎn)換，并促進(jìn)經(jīng)15-LO途徑的SPMs合成［12］。但過多的COX-2表達(dá)也可能會(huì)抑制5-LO和15-LO基因的表達(dá)［13］。本研究顯示，脾虛導(dǎo)致COX-2水平的異常升高，這與前期研究顯示的脾虛導(dǎo)致PGE2水平異常升高的結(jié)果是一致的［5］。而各組COX-2水平在42h比18h水平仍顯著升高，與NF-κBp65活性變化結(jié)合來看，提示在這兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)間可能還存在炎癥高峰期。

CysLTs和LXs均為AA的代謝產(chǎn)物，LXA4/CysLTs若出現(xiàn)不平衡，可導(dǎo)致哮喘發(fā)作或加重。CysLTs為促炎介質(zhì)，5-LO是其合成的關(guān)鍵酶，在體內(nèi)主要由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞通過單細(xì)胞或者跨細(xì)胞途徑合成；以LXA4為代表的LXs為促炎癥消退介質(zhì)，5-LO和15-LO 是其合成的關(guān)鍵酶［10，14］。

筆者前期的研究結(jié)果表明，脾虛導(dǎo)致哮喘炎癥的消退延緩，可能與LXA4/CysLTs之間的失衡有關(guān)［5］。本研究結(jié)果顯示，脾虛導(dǎo)致15-LO水平升高緩慢，這與脾虛導(dǎo)致LXA4升高緩慢，使LXA4/CysLTs失衡的結(jié)果是一致的；但脾虛并未導(dǎo)致5-LO水平的明顯變化，這可能與5-LO同時(shí)參與促炎介質(zhì)和促炎癥消退介質(zhì)生成的雙重角色有關(guān)。

捏脊法既是一種外治法，又是小兒推拿最常用的手法之一，防治兒童哮喘有較好的臨床效果［8-9］。捏脊法循督脈和足太陽膀胱經(jīng)操作，善于健脾、調(diào)理臟腑［15］。本研究顯示，捏脊法有助于降低脾虛大鼠肺組織的COX-2水平，提升15-LOX水平，并減輕NF-κBp65的激活，這可能是其改善脾虛哮喘促炎/促炎癥消退介質(zhì)平衡，促進(jìn)肺部炎癥消退的機(jī)制之一。

本研究表明，脾虛導(dǎo)致哮喘大鼠15-LO水平升高緩慢，COX-2水平異常升高，肺組織NF-κBp65的活性增加。捏脊法可提升脾虛哮喘大鼠肺組織15-LO水平，降低COX-2水平，降低NF-κBp65的活性，這可能是其干預(yù)兒童哮喘的重要機(jī)制之一。