黃酒對便秘模型小鼠通便及腸道菌群的影響

王麗媛，秦 文，李 巖，卓 勤，孫 靜，王晶波，楊 倬，黃 建，沈 葹，霍軍生，丁鋼強*

（中國疾病預防控制中心 營養與健康所，北京 100050）

黃酒是我國最古老的酒種，在中國乃至世界酒文化歷史上都占有重要的一席。作為我國最有發展前途的酒種之一，黃酒的功效已被大眾熟知并廣泛應用。古今中外已有諸多記載，如《漢書·食貨志》中記載：“酒，百藥之長”；《本草綱目》記載：“諸酒醇不同，唯米酒入藥用”。米酒即指黃酒，具有通曲脈、厚腸胃、潤皮膚、養脾氣、扶肝、除風下氣等治療作用[1]。

隨著研究的深入，越來越多的結果顯示黃酒在抗氧化、抗衰老以及代謝、免疫調節等方面具有良好功效[2]，這與黃酒中所含有的礦物質、維生素、活性肽、糖類尤其是低聚糖密切相關[3]。功能性低聚糖是在黃酒釀造過程中曲麥微生物酶的作用下產生的[4]，具有低甜度和低熱量的特點，被人們稱為“膳食纖維”。已有研究表明，功能性低聚糖具有促進營養元素的吸收利用及改善便秘等功效[5]，在人體胃中能抵抗胃酸的分解和α-淀粉酶的水解，具有較好的穩定性，能夠進入腸道發揮益生元的作用[6]，而黃酒對便秘癥狀的改善作用研究較少。本實驗意在研究黃酒對小鼠通便功能作用，以及對便秘小鼠腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性BALB/c小鼠共100只（無特定病原體（specific pathogenfree，SPF）級，體質量18～22g，[生產許可證：SCXK（京）2014-0006]）：購于斯貝福（北京）生物技術有限公司；動物飼養于中國疾病預防控制中心南緯路動物實驗室，許可證號SYXK（京）2009-0032，室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，12 h光照，12 h黑暗。動物實驗已通過中國疾病預防控制中心營養與健康所倫理審查。

受試樣品：市售黃酒，標示酒精度為15.0%vol。

藥物及試劑：鹽酸洛哌丁胺膠囊（每粒含鹽酸洛哌丁胺2 mg，國藥準字H10910085）：西安楊森制藥有限公司；阿拉伯樹膠：國藥集團化學試劑有限公司；活性炭粉、墨汁的配制：準確稱取阿拉伯樹膠10 g，加水80 mL，煮沸至溶液透明，稱取活性炭5 g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液冷卻后加水定容至100 mL，于4℃保存備用，用前搖勻。0.5%鹽酸洛哌丁胺混懸液的配制：取鹽酸洛哌丁胺50mg（25粒），加水至10 mL；1%鹽酸洛哌丁胺混懸液的配制：取鹽酸洛哌丁胺100 mg（50粒），加水至10 mL。均臨用前配制。

1.2 儀器與設備

RV10 V-C旋轉蒸發儀：德國IKA公司；ME403E天平：瑞士梅特勒公司；AC2-4S1生物安全柜：新加坡ESCO公司；5427R高速冷凍離心機：德國EPPENDRF公司；Illumina HiSe2500測序儀：美國Illumina公司；NANO DROP紫外分光光度計：美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 小腸墨汁推進率實驗

健康雄性BALB/c小鼠共50只，適應性飼養3 d，按體質量隨機分為空白對照組、模型對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各10只。人體推薦量的10倍為中劑量組，另設5倍低劑量組和30倍高劑量組。按照《中國居民膳食指南》2016新版建議男性每日飲酒的酒精量不超過25 g為參照，標準人體質量60 kg計算，人體每日飲酒量為100 mL，低劑量組=8.3mL/（kg·BW）、中劑量組=16.6mL/（kg·BW）、高劑量組=50mL/（kg·BW）。將黃酒進行濃縮，用15%vol酒基按比例進行調配。高、中、低劑量組灌胃受試樣品，空白對照組和模型對照組給予蒸餾水，灌胃體積0.2mL/（10g·BW）。連續灌胃15 d后，各組小鼠禁食不禁水24 h。除空白對照組外，其他各組以0.5%鹽酸洛派丁胺混懸液，按末次稱質量對應的灌胃量給予灌胃，空白組灌胃蒸餾水。30 min后以0.4 mL每只給予各組小鼠墨汁灌胃，25 min后立即脫頸椎處死，解剖分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，輕拉成直線，測量小腸總長度及墨汁推進最前端長度，計算小腸墨汁推進率。

1.3.2 排便時間及糞便質量實驗

另50只健康雄性BALB/c小鼠，實驗方法同小腸推進率實驗。便秘藥物為1%鹽酸洛派丁胺混懸液。小鼠墨汁灌胃后，動物均單籠飼養，正常飲水進食。從灌墨汁開始，記錄每只動物首粒排黑便時間及5 h內排黑便的質量。

1.3.3 腸道菌群分析

無菌環境下收集排便實驗組所有動物的新鮮糞便，封裝后凍存于-80℃冰箱進行DNA提取與分析。小鼠糞便DNA提取采用華大基因自行研發試劑盒，使用通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16SrDNA的V4區進行PCR擴增。

應用Illumina HiSe2500平臺對PCR產物進行測序，測序類型為PE250。下機數據濾除低質量的reads，獲得clean data。序列拼接使用軟件FLASH（Fast Length Adjustment of Shortreads，v1.2.11），將雙末端測序得到的reads拼接成Tags，利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將優化好的Tags在97%的相似度下聚類為分類操作單元（operational taxonomic units，OTU），用于物種注釋及物種復雜度分析以及組間物種α-多樣性分析。

1.3.4 統計學方法

數據分析采用軟件SPSS16.0處理，各組以變異數ANOVA進行比較分析，數據以xˉ±s表示，P≥0.05無顯著差異，0.01≤P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 黃酒對小鼠體質量的影響

表1 小腸墨汁推進率實驗各組小鼠體質量檢測結果Table 1 Determination results of body mass of mice in the ink propelling rates experimental group

表2 排便實驗各組小鼠體質量的檢測結果Table 2 Determination results of body mass of mice in defecation experimental group

由表1、表2可知，在小腸推進率和排便兩組實驗開始前，各組實驗動物體質量沒有顯著差異（P≥0.05）。15 d的灌胃過程中，高劑量組小鼠的體質量增長緩慢，在第7天和第15天小鼠體質量與模型對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。實驗結束后，高劑量組與模型組小鼠體質量增量差異極顯著（P＜0.01）。在實驗過程中，各組小鼠均保持正常進食進水，毛色正常，精神狀態良好。

2.2 黃酒對便秘小鼠小腸墨汁推進率的影響

采用鹽酸洛派丁胺為便秘誘導劑，通過抑制腸道水分泌[7]和結腸蠕動[8]建立便秘模型。表3結果顯示，便秘模型對照組小腸推進率與空白對照組差異極顯著（P＜0.01），表明小腸推進實驗中便秘模型建立成功。經統計分析，高、中、低三個劑量組與便秘模型組差異不顯著（P≥0.05）。未見黃酒對便秘小鼠小腸蠕動有明顯促進作用。

表3 各組小鼠小腸墨汁推進率的檢測結果Table 3 Determination results of the ink propelling rates of different groups of mice

2.3 黃酒對便秘小鼠首粒排黑便時間和糞便質量的影響

表4 各組小鼠首粒黑便排出時間和糞便質量的檢測結果Table 4 Determination results of the time of discharge of the first black feces and fecalmass of different groups of mice

表4結果顯示，模型對照組與空白對照組相比，首粒排黑便時間和糞便質量差異極顯著（P＜0.01），表明便秘模型建立成功。高、中、低劑量組與模型對照組之間差異不顯著（P≥0.05），表明黃酒沒有明顯通便功能作用。

2.4 黃酒對便秘小鼠腸道菌群的影響

2.4.1 各試驗組小鼠腸道菌群多樣性分析

表5 小鼠腸道菌群α-多樣性統計分析Table 5 Alpha diversity statistical analysis of intestinal flora in mice

Alpha多樣性（Alphadiversity）是對單個樣品中物種多樣性的分析[9]，其中Chao指數和Ace指數反應樣本的物種豐富度，Simpson指數和Shannon指數綜合反應群落的多樣性，受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。相同物種豐富度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認為群落具有越大的多樣性。由表5可知，在物種多樣性方面，模型對照組顯著低于空白對照組（P＜0.05），高、中、低劑量組與模型對照組差異不顯著（P≥0.05），與有關研究便秘模型腸道菌群α-多樣性分析結果一致[10]。高劑量組和中劑量組在物種豐富度上顯著高于模型對照組（P＜0.05）。

2.4.2 各試驗組小鼠腸道菌群門水平變化

腸道菌群按照生理作用可分為三類：生理性菌群，主要包括雙歧桿菌、乳桿菌等專性厭氧菌，為腸道優勢菌，對腸道正常生理功能起保護作用；條件致病菌，大腸埃希氏菌、腸球菌、梭菌等，多為專性厭氧菌，僅在滿足特定條件下對宿主產生影響；病原菌多為變形桿菌等，如在腸道長期定殖并大量繁殖可導致人體發病[11-12]。16SrDNA技術的應用，使得DNA測序更加準確的分析腸道菌群種類及其結構組成[13-14]。

50個樣品共計產生683個OTU，分屬于10個細菌門。各試驗組的大部分腸道菌群屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）、柔膜菌門（Tenericutes），見圖1。由圖1可知，造成便秘高、中、低、模型對照組與空白對照組相比，厚壁菌門顯著降低，降低比例分別為34%、17%、36%、31%。疣微菌門和藍藻菌門顯著增加，疣微菌門增加比例均100%以上，藍藻菌門增加比例分別為59%、84%、52%、43%。

圖1 各組小鼠腸道菌群門水平豐度圖Fig.1 Phylum-level abundance of intestinal flora in different groups of mice

2.4.3 各試驗組小鼠腸道菌群屬水平變化

在屬的水平上，嗜粘蛋白-艾克曼菌屬（Akkermansia）、擬桿菌屬（Bacteroides）、Dorea屬、Odoribacter桿菌屬、顫螺菌屬（Oscillospira）、副桿菌屬（Parabacteroides）、副普雷沃氏菌屬（Paraprevotella）、雷沃氏菌屬（Prevotella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）含量豐富（＞1%）。高、中、低三個劑量組與模型對照組相比擬桿菌屬含量分別降低64%、59%、64%，腸球菌含量分別降低37%、47%、87%，梭菌屬含量分別降低63%、46%、13%，變形桿菌含量分別降低86%、100%、100%；高劑量組嗜粘蛋白-艾克曼菌屬（主要是Akkermansia muciniphila）、乳桿菌屬的含量較模型對照組分別升高41%、38%。

黃酒中豐富的功能性低聚糖[15]能夠被腸道有益菌吸收，改善微生態環境，有利于有益菌的增值，經代謝產生的有機酸使腸內的pH值降低[16]，低pH值環境能夠調節促進專性厭氧菌在腸道的定植，使短鏈脂肪酸競爭性結合腸道上皮細胞或粘膜上受體結合位，以提高厭氧菌定植抗力[17-18]，抑制腐敗菌的生長，調節胃腸功能[19]。

已有研究表明，Akkermansia muciniphila是腸道中的一種黏蛋白降解菌[20]，在肥胖及相關代謝疾病（如糖尿病）中具有關鍵作用[21]，其組成比例與宿主健康存在正相關[22]，有望成為新一代的益生菌[23]。結合本實驗結果，推測鹽酸洛派丁胺可能引起Akkermansia muciniphila含量增高，而高劑量黃酒也有顯著增加該菌含量的可能性，進一步推測高劑量黃酒組動物體質量增長緩慢和該菌含量可能有相關性，有待深入研究。

圖2 各組小鼠腸道菌群屬水平豐度圖Fig.2 Genus-level abundance of intestinal flora in different groups of mice

3 結論

黃酒沒有顯著促進BALB/c小鼠小腸蠕動，沒有顯著縮短小鼠首粒排黑便時間以及提高糞便質量，表明黃酒在通便功能上作用不明顯。50.0 mL/（kg·BW）劑量黃酒小鼠體質量增長緩慢，明顯低于其他各組，該劑量黃酒在維持體質量方面具有一定作用。黃酒能夠調節便秘小鼠腸道菌群結構，提高菌群豐富度，高劑量黃酒能夠提高嗜粘蛋白-艾克曼菌、乳桿菌的含量，并降低擬桿菌、腸球菌、梭菌和變形桿菌的比例。