激動核受體RXR對大鼠心肌細胞饑餓損傷中自噬和凋亡的雙重調控作用

單培仁 余靈芳 周昌鉆 朱千里 黃周青 陳晨

缺血性心臟病，尤其是急性心肌梗死，在全球有較高的發病率和病死率。雖然緊急再灌注治療可降低病死率，但梗死后心室重構導致的心力衰竭仍是一個非常嚴重的問題。細胞自噬和凋亡發生貫穿于心肌梗死后的整個病理生理過程[1-2]。凋亡是細胞程序性死亡的一種形式，抑制凋亡可改善心肌梗死后的心臟功能[2]。自噬是細胞降解和回收細胞器和長壽蛋白的主要代謝途徑，在心肌細胞中自噬起著雙重作用，在不同的病理條件下表現出保護或有害作用，調控自噬已成為當前心血管疾病治療的重要靶點[1-3]。

維甲類X受體（retinoid X receptor，RXR）是眾多核受體中的獨特一員，能與其它眾多細胞核受體發生交互作用，在細胞增殖、分化、凋亡等方面發揮重要功能[4-5]。我們前期的研究表明，激動核受體RXR可以保護心肌細胞氧化應激損傷，但其機制還不是很明確，尤其是在自噬水平中的調控作用[6]。為此，我們采用大鼠心肌細胞株H9c2建立無糖無血清（serum and glucose deprivation,SGD）饑餓狀態損傷模型，用RXR激動劑9-順式維甲酸 （9-cis retinoid acid，c-RA）、RXR 拮抗劑HX531進行干預，觀察激動核受體RXR對H9c2細胞SGD損傷的保護作用，探討其可能機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 無糖Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM，美國 Gibco公司，批號：1930192，規格：500ml）、高糖 DMEM（美國 Gibco 公司，批號：8118168，規格：500ml）、FBS（美國 Gibco 公司，批號：1828728，規格：500ml）、c-RA（美國 Sigma 公司，批號：533-3-8，規格：10mg），JC-1試劑盒（美國 Molecular Probes公司，貨號：M34152，規格：1 kit），NucViewTM488 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3試劑盒（美國Biotium，Inc，批號：10402，規格：100μl），Western blot法檢測所用的兔多克隆抗Bax（美國Cell Signaling公司，批號：2772s，規格：100μl）、Bcl-2（美國 abcam 公司，批號：ab59348，規格：100μg）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-9（美國 Cell Signaling公司，批號：20750，規格：100μl）及 β-肌動蛋白抗體（美國 Cell Signaling 公司，批號：4970，規格：100μl），HX531 由日本東京大學Dr.Hiroyuki Kagech贈送。

1.2 細胞株及培養 將大鼠心肌細胞株H9c2（購自美國典型培養物保藏中心）用含10%FBS高糖DMEM培養基在37℃、5%CO2條件下培養，細胞生長密度達90%時予以3∶1傳代。

1.3 細胞分組及培養 將傳代接種于培養板生長24h的細胞按隨機數字表法分為4組并按以下方法干預：（1）對照組（C組）：10%FBS高糖DMEM培養基中加入0.1%的二甲基亞砜培養6h；（2）SGD組：無糖DMEM中培養6h；（3）RA組：向培養液中加入終濃度為100nmol/L c-RA預處理1h后，在無糖DMEM中培養6h；（4）HX組：向培養液中加入終濃度2.5μmol/L HX531預處理0.5h，再加入終濃度為100nmol/L c-RA處理1h后，在無糖DMEM中培養6h。干預后采用透射電鏡檢測心肌細胞自噬小體。

1.4 MTT法檢測細胞活力 用培養基調整細胞濃度，每孔200μl，各實驗組的藥物處理后，每孔加入5mg/ml MTT試劑20μl，37℃孵育4h，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜 200μl，37℃孵育 20min，用酶標儀 Elx800 microplate reader（美國BioTek）在波長570nm下檢測光密度（空白對照為不加細胞只加培養液，空白孔調零）。

1.5 JC-1流式細胞法檢測細胞凋亡百分比及Caspase-3活力 根據細胞熒光顏色和強度不同判斷凋亡細胞，計數10 000個細胞后，以凋亡細胞數除以10 000作為細胞凋亡百分比。收集各組細胞，加入5μg/ml JC-1探針 37°C孵育30min，溫PBS洗1次，上流式細胞儀（FACS Calibur,美國BD公司）檢測細胞凋亡百分比（激發光488 nm，散發光 530nm 和 585nm）[6-7]。Caspase-3活化是細胞凋亡的重要標志，本研究采用流式法測量平均熒光強度（MFI）來反映Caspase-3活力。以1×105/孔細胞密度接種于6孔板中，在各組處理后，用胰酶消化，PBS重懸，加入2μmol/L NucView 488 Caspase-3底物避光孵育15min，PBS洗1次，上流式細胞儀檢測（激發光488nm，散發光530nm），求得MFI，以C組所測的MFI為1，其余孔測得的MFI與其比值來表示Caspase-3活力。

1.6 Western blot法檢測蛋白表達 包括凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及下游活性片段Caspase-9蛋白表達，以及自噬相關蛋白LC3、Beclin 1表達。收集經試驗處理的細胞，加入細胞裂解液，4℃搖床上裂解20min，在4℃下以12 000r/min離心15min，收集上清液即為全細胞裂解液。用BCA法定量蛋白，取等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳、轉膜、抗體孵育等步驟后，用免疫印跡化學發光試劑孵育后，X線膠片曝光，曝光顯影的目的條帶用Image J處理軟件進行半定量分析，以內參為參考標準計算出目的條帶標準化后的光密度值，并以此判斷蛋白的表達水平。

1.7 統計學處理 采用SAS 6.12統計軟件，測得計量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組心肌細胞活力的比較 見圖1。

圖1 4組心肌細胞活力的比較（與C組比較，*P＜0.01；與SGD組比較，△P＜0.01）

由圖1可見，與C組比較，SGD組和HX組心肌細胞活力均下降（均P＜0.01）；與SGD組比較，RA組心肌細胞活力上升（P＜0.01）。

2.2 4組心肌細胞凋亡百分比比較 見圖2。

由圖2可見，與C組比較，SGD組和HX組心肌細胞凋亡百分比均上升（均P＜0.01）；與SGD組比較，RA組心肌細胞凋亡百分比明顯下降（P＜0.01）。

2.3 4組心肌細胞Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白水平比較 見圖3。

圖2 4組心肌細胞凋亡百分比比較（a：JC-1結合流式細胞法測量細胞凋亡百分比，右下象限表示凋亡細胞；b：各組凋亡百分比條狀圖；與 C 組比較，*P＜0.01；與 SGD 組比較，△P＜0.01）

圖 3 4組心肌細胞 Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白水平比較（a：Westernblot法檢測Bcl-2、Bax及活性片段Caspase-9蛋白表達電泳圖；b：半定量分析各蛋白表達條狀圖，設C組Bax/Bcl-2、Caspase-9表達為1，與C 組比較，*P＜0.01，與SGD 組比較，△P＜0.01）

由圖3可見，SGD干預可誘導Bcl-2表達下調，Bax表達上調，引起Bax/Bcl-2比值上升，并伴有Caspase-9蛋白水平增高。與C組比較，SGD組和HX組心肌細胞Bax/Bcl-2比值和Caspase-9蛋白水平均上升（均P＜0.01）；與SGD組比較，RA組心肌細胞Bax/Bcl-2比值和Caspase-9蛋白水平明顯下降（均P＜0.01）。

2.4 4組Caspase-3活力比較 見圖4。

圖4 4組Caspase-3活力比較（a：波峰右移表示熒光增強，反映Caspase-3活力增高；b：各組Caspase-3活力條狀圖，以各組與C組M FI的比值表示，與對照組比較，*P＜0.01，與SGD組比較，△P＜0.01）

由圖4可見，SGD組MFI值波峰明顯右移，MFI值為C組的2.3倍（P＜0.01）；而RA組波峰出現明顯左移，MFI值僅為C組的1.3倍，明顯低于SGD組（P＜0.01）；HX組波峰與SGD組相似，MFI值顯著高于C組（P＜0.01）。

2.5 4組間自噬水平及相關蛋白水平的比較 見圖5。

圖5 4組自噬水平及相關蛋白水平的比較（a：透射電鏡下觀察細胞內自噬小體；b：W est ern bl ot法檢測Becl i n 1及LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達電泳圖；c：半定量分析各蛋白表達條狀圖，設C組Becl i n 1及LC3-Ⅱ/Ⅰ表達為 1，與C組比較，*P＜0.01，與SGD組比較，△P＜0.01）

由圖5可見，C組中細胞質內細胞器完整，而SGD組和HX組自噬小體數增加，其內含有被吞噬的線粒體等結構，部分呈空泡樣改變，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ比值上升，Beclin 1表達增加（均P＜0.01）；RA組心肌細胞自噬小體數量明顯減少，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值下調，Beclin 1蛋白表達水平降低（均P＜0.01）。

3 討論

盡管自噬的概念早在幾十年前就已形成，但它在病理過程中的確切作用仍不清楚。心肌細胞是不可再生的終末分化細胞，自噬在穩定心肌細胞內環境，維持正常的心臟結構和功能中起著非常重要的作用[1-3]。

本研究中建立了心肌細胞饑餓模型，結果顯示細胞凋亡和自噬水平均明顯升高，這與既往的文獻報道一致[8-9]。心肌細胞營養缺乏是一種常見的臨床事件，它介導各種心臟缺血過程，如冠心病和心力衰竭。為了應對饑餓，自噬上調，雙膜自噬體將損害的細胞器或部分細胞質隔離，并與溶酶體融合水解酶，為能量生成提供了內在的營養來源，從而促進生存[8-9]。

我們發現，激動RXR能明顯抑制饑餓狀態下的凋亡水平，其與抑制線粒體凋亡通路相關。早期就有研究顯示RXRα突變胎鼠在心肌能量代謝上存在明顯異常，超微結構顯示線粒體數量增多，但ATP含量卻明顯減少，說明RXRα在維持心肌細胞線粒體結構和功能中存在重要作用。而線粒體是細胞中維持內環境穩定非常重要的細胞器[10]。所以我們認為，c-RA在激動RXR后，穩定了線粒體膜電位，穩定了細胞內環境，減少外源性有害物質刺激誘發凋亡作用。這與既往的研究類似[6]，但RXR受體在心肌細胞中的自噬調控作用尚不清楚。

在本研究中，我們也發現激動RXR能抑制自噬水平，增加心肌細胞活力。這也間接說明了在當前的饑餓狀態模型下，自噬是有害的，這與我們前期的研究類似：在心肌細胞缺氧/復氧損傷中自噬起到致命性作用，抑制自噬可保護心肌細胞缺氧/復氧誘導的氧化應激損傷，而增強自噬將惡化心肌損傷[7]。既往對自噬的功能意義一直存在諸多爭議，比如即使在相同的病理條件下（如饑餓），自噬既能發揮促生存作用，又存在導致死亡的風險。因此，目前認為自噬的程度似乎是決定它將發揮保護或有害作用的關鍵[11]。

自噬和凋亡在饑餓反應中同時發生，兩者間的相互作用是決定程序性細胞死亡的關鍵[12]。但它們間相互作用的確切機制尚不清楚，目前認為Beclin1和Bcl-2家族不僅是自噬和凋亡信號通路發生交互作用的靶點，而且也可能是平衡自噬強度的潛在靶點，自噬現象究竟是誘導細胞存活還是死亡可能取決于Bcl-2與Beclin1之間的平衡[12-14]。Bcl-2是抗凋亡蛋白中重要成員，在線粒體外膜發揮作用，以維持膜的完整性。Beclin 1能與Bcl-2發生相互作用，被認為是自噬的重要調控因子。Beclin 1與Bcl-2家族的抗凋亡多域蛋白相互作用，尤其是Bcl-2及其同源物Bcl-X（L），其BH3域為同時具有親水和疏水部分的α螺旋，與Bcl-2/Bcl-X（L）的疏水性裂隙結合[15]。研究表明，Bcl-2與Beclin1的相互作用通過干擾自噬啟動子復合物Beclin1/hVps34的形成和活性，導致自噬的抑制。本研究發現激動RXR能上調Bcl-2蛋白，同時下調Beclin 1蛋白，這說明RXR可能是通過調節Bcl-2和Beclin1蛋白表達，而發揮抗凋亡和抗自噬作用，但具體的上游通路還有待進一步研究。

總之，本研究證明了激動RXR在饑餓狀態下抑制心肌細胞凋亡和自噬的發生，可保護心肌細胞在饑餓狀態下的生存。