假蒟對去卵巢糖尿病骨質疏松大鼠血糖、骨代謝、氧化應激的影響

楊迪 馮法博 朱丹杰 李曉林 鄒成 沈潔 趙瑜

流行病學調查顯示我國成年人2型糖尿病患病率為9.7%～11.6%[1]。研究表明糖尿病患者發生骨質疏松的風險明顯高于非糖尿病患者，發病機制考慮為糖尿病患者破骨細胞活性增加，成骨細胞活性下降[2-4]。絕經后女性體內雌激素水平急劇降低，活性氧的增加誘導破骨細胞分化和增殖，易引發骨質疏松[5]。絕經后的2型糖尿病患者存在年齡、絕經、糖尿病等骨質疏松的多重危險因素，應成為防治骨質疏松的重點人群。假蒟來源于胡椒科植物假蒟的地上部分，研究發現假蒟葉水提取物具有較好的抗氧化活性，細胞及動物實驗證實其對糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓有預防和治療作用[6-8]。由于氧化應激在糖尿病及其并發癥、骨質疏松的發病機制中起著重要作用，而假蒟具有降低血糖、抗氧化應激功能，因此推測使用假蒟能降低糖尿病患者發生骨量減少、骨質疏松的風險。本研究通過對雌性SD大鼠去卵巢手術后腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）的方法，復制伴有2型糖尿病的骨質疏松大鼠模型，旨在觀察假蒟對去卵巢糖尿病骨質疏松大鼠血糖、骨代謝指標、氧化應激指標、骨小梁的影響，探討其對去卵巢糖尿病骨質疏松大鼠的治療作用及其機制，為假蒟的臨床應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 2月齡清潔級雌性SD大鼠50只，體質量180～200g，購于浙江省實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（浙）2014-0001。所有動物于浙江省實驗動物中心屏障環境飼養，使用許可證號：SYXK（浙）2014-0008。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器 3kg烘干假蒟葉購自浙江省中醫院，切成小片狀，加入蒸餾水（每900ml蒸餾水中加入100g烘干假蒟葉）后煮沸，并以不低于80℃的溫度持續煎煮3h，假蒟水提取物通過冷凍-干燥后被濃縮和干燥成粉末；密封裝瓶，提取粉末在4℃冰箱保存直至使用。STZ（美國 Sigma公司），戊酸雌二醇（E2）（拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司），格列本脲（江蘇正大天晴藥業股份有限公司），TC、TG、鈣（Ca）、磷（P）、骨鈣素（OC）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物科技有限公司），空腹胰島素（FINS）、糖化血清蛋白（GSP）、E2ELISA 試劑盒（杭州昊天生物科技有限公司），BX60熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司），硬組織切片機（德國Leica2500E），DP70彩色數碼成像系統（北京華躍英泰科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組及去卵巢糖尿病骨質疏松大鼠模型建立 50只大鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法分為模型組、格列本脲組、E2組、假蒟組和假手術組5組，每組10只。所有大鼠用10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉，假手術組找到卵巢后不予結扎摘除，只切除雙側卵巢周圍少許脂肪組織；另外4組用線結扎輸卵管，切除雙側卵巢建立絕經后骨質疏松大鼠模型。術后1周，去卵巢大鼠腹腔注射STZ（35mg/kg），72h后檢測空腹血糖（FBG），以FBG≥11.1mmol/L作為糖尿病模型成功的標志。去卵巢糖尿病大鼠飼養10周，形成去卵巢糖尿病骨質疏松模型。

1.3.2 各組給藥方法 模型組和假手術組采用0.9%氯化鈉溶液灌胃，8ml（/kg·d）。格列本脲組采用格列本脲（配成0.625mg/ml濃度）灌胃，5mg（/kg·d）。E2組采用E2（配成12.5μg/ml濃度）灌胃，100μg（/kg·d）。假蒟組采用假蒟（配成15.625mg/ml濃度）灌胃，125mg（/kg·d）。各組均連續給藥4周。

1.3.3 實驗指標檢測 藥物干預結束后，禁食24h，10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血并分離血清，全自動生化檢測儀測量生化指標（TC、TG、Ca、P、FBG），采用 ELISA 法檢測 FINS、GSP、E2、晚期糖基化終末產物（AGEs），試劑盒檢測氧化應激指標（SOD、MDA）和骨代謝指標（OC、AKP）。

1.3.4 組織學檢測 10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉后急性大失血法（腹主動脈取血）處死各組大鼠。取各組大鼠左側股骨，4%多聚甲醛固定24h，20%甲酸和15%乙二胺四乙酸脫鈣14d，各級乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察骨組織病理形態學改變。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；組內比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠干預前后血清FBG水平比較 干預前，假手術組血清FBG水平均明顯低于其他4組（均P＜0.01）。干預后，格列本脲組、假蒟組、假手術組血清FBG水平均低于模型組（均P＜0.05），格列本脲組、E2組、假蒟組血清FBG水平均高于假手術組（均P＜0.05）。干預后，假蒟組與格列本脲組血清FBG水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。干預后，模型組、E2組血清FBG水平均較干預前升高（均P＜0.05），但格列本脲組、假蒟組、假手術組干預前后血清FBG水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 各組大鼠干預后生化指標比較 干預后，格列本脲組、假蒟組、假手術組血清TC水平均低于模型組（均P＜0.05），格列本脲組、E2組血清TC水平均高于假手術組（均P＜0.05）。格列本脲組、E2組、假蒟組、假手術組血清TG水平均低于模型組（均P＜0.05）。E2組、假手術組血清E2水平均高于模型組（均P＜0.05），格列本脲組、E2組、假蒟組血清E2水平均低于假手術組（均P＜0.05）。模型組、E2組血清FINS水平均低于假手術組（均P＜0.05）。模型組、格列本脲組、E2組、假蒟組血清GSP水平均高于假手術組（均P＜0.05）。但各組血Ca及P比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

表1 各組大鼠干預前后血清FBG水平比較（m m ol/L）

表2 各組大鼠干預后生化指標比較

2.3 各組大鼠干預后骨代謝指標比較 格列本脲組、E2組、假蒟組、假手術組血清AKP水平均低于模型組（均P＜0.05），格列本脲組、E2組、假蒟組血清AKP水平均高于假手術組（均P＜0.05）。但各組血清OC水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠干預后骨代謝指標比較

2.4 各組大鼠干預后氧化應激指標比較 假蒟組血清SOD活性分別高于假手術組、模型組（均P＜0.05），格列本脲組血清SOD活性高于假手術組（P＜0.05）。假蒟組、假手術組血清MDA水平均低于模型組（均P＜0.05）。格列本脲組、假蒟組、假手術組血清AGEs水平均低于模型組（均P＜0.05），E2組血清AGEs水平高于假手術組（P＜0.05），見表 4。

表4 各組大鼠干預后氧化應激指標比較

2.5 各組大鼠骨組織病理形態學改變比較 與假手術組比較，模型組、格列本脲組、E2組大鼠骨松質部位骨小梁明顯減少，排列稀疏、不整齊，部分斷裂，模型組中這種病理變化更加嚴重；假蒟組骨小梁數量減少不明顯，排列較規則，連續性、完整性較好，見圖1。

圖1 各組大鼠骨組織病理形態學改變（a：假手術組；b：E2組；c：格列本脲組；d：假蒟組；e：模型組；H E染色，×200倍）

3 討論

高血糖是糖尿病的主要特征，糖尿病慢性并發癥主要通過長期持續性高血糖和血糖波動兩種方式產生，而其核心是氧化應激[9-10]。在高糖和（或）氧化應激條件下，體內脂質過氧化產物MDA和AGEs水平增加，積累的AGEs一方面可通過與其受體結合促進SOD等抗氧化酶糖基化，削弱機體清除自由基的能力，加重氧化應激及炎癥反應，造成多種糖尿病慢性并發癥；另一方面可通過減少成骨細胞活性，誘導破骨細胞形成和受損的骨基質礦化等影響骨重建過程，造成骨質損傷，是糖尿病骨質疏松的主要成因[11]。因此對血清MDA、AGEs水平和SOD活性持續監測可以明確氧化應激狀態及評估抗氧化療效[12]。

本研究顯示藥物干預后，與模型組比較，假蒟組SOD活性升高，MDA水平下降，說明假蒟具有抗氧化應激作用；格列本脲組、假蒟組血清AGEs水平均低于模型組。綜上，試驗結果證明假蒟可減輕氧化應激誘導的損傷，推測假蒟可能對去卵巢糖尿病骨質疏松存在改善作用。

本研究顯示干預前模型組、格列本脲組、E2組、假蒟組血清FBG水平均高于假手術組，差異均有統計學意義，說明糖尿病模型成功。干預后，格列本脲組、假蒟組血清FBG水平均低于模型組，說明格列本脲、假蒟有降糖作用。干預前后格列本脲組與假蒟組血清FBG、FINS水平比較差異均無統計學意義，說明假蒟與格列本脲相比，在降糖作用方面具有非劣效性，推測假蒟可能存在促進胰島素分泌作用。本研究中模型組大鼠出現血清TG、TC水平升高，干預后假蒟組血清TG、TC水平較模型組均下降，差異均有統計學意義，這與Mohd等[7]研究結果一致，推測假蒟可能具有降脂作用。

骨形成和骨吸收是骨代謝中兩個緊密相聯的過程。OC是由成骨細胞產生和分泌的一種激素樣多肽，是骨形成的特異而敏感的指標，當骨更新率加快時，血中OC升高；AKP是反映骨重建指標之一；OC和AKP是目前常用的骨形成標志物。去卵巢大鼠由于雌激素的缺失會代償性增加OC、AKP分泌，去卵巢骨質疏松為高轉換型，而糖尿病骨質疏松為低轉換型，在復合模型中，可能兩者互相影響，從而導致部分指標變化不明顯。本研究中，模型組血清AKP水平高于假手術組，處于高轉換狀態；干預后格列本脲組、E2組、假蒟組血清AKP水平均低于模型組。因此，推測假蒟具有降低骨轉換，抑制骨吸收的作用。

本研究顯示，與假手術組比較，模型組、格列本脲組、E2組大鼠骨松質部位骨小梁明顯減少，排列稀疏、不整齊，部分斷裂，模型組中這種病理變化更加嚴重；假蒟組骨小梁數量減少不明顯，排列較規則，連續性、完整性較好。說明假蒟對去卵巢糖尿病骨質疏松具有改善作用，下一步需增加樣本量對骨質疏松改善程度進行量化。

本研究結果表明，假蒟降糖效果非劣效于格列本脲，其可能通過改善高血糖狀態、抗氧化應激，從而抑制去卵巢糖尿病骨質疏松模型大鼠骨代謝紊亂。