轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2對急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用研究

陳茜圓 黃曉軍 任卓超 金興

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性彌漫性肺損傷和進(jìn)而發(fā)展的急性呼吸衰竭。ALI已成為嚴(yán)重感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷和大面積燒傷等患者死亡的主要原因之一。ALI的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，目前尚無強(qiáng)力的、安全有效的藥物治療手段。故進(jìn)一步研究ALI的發(fā)病機(jī)制，探尋新的方法預(yù)防和治療ALI，刻不容緩。研究表明，被激活的各種細(xì)胞經(jīng)呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）引起氧化應(yīng)激狀態(tài)，在ALI發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[1-2]。在生理情況下ROS是通過細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE）調(diào)控的相關(guān)解毒、抗氧化酶去除和降解的。Venugopal等[3]和Itoh等[4]最先提出轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）在驅(qū)動ARE調(diào)控基因中的作用，后續(xù)研究使得Nrf2參與ARE調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制越來越清楚[5]。目前研究已證實(shí)Nrf2在一系列高氧化應(yīng)激狀態(tài)的疾病中都有保護(hù)作用，并決定機(jī)體對氧化應(yīng)激的敏感性和機(jī)體炎性反應(yīng)的嚴(yán)重程度[6-8]。國外已有少量研究證實(shí)Nrf2在ALI中的保護(hù)作用，但在國內(nèi)此類研究報(bào)道極少[9]。Nrf2的研究將為臨床上ALI的預(yù)防和治療提供一個新的靶點(diǎn)。本研究探討Nrf2對ALI小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6～8周雄性小鼠36只，清潔級Ⅱ級，體質(zhì)量18～20g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供。室溫(18～22℃)、安靜環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)，晝夜交替，自由適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 儀器和試劑 Gem premier 3000血?dú)夥治鰞x（美國GE公司）；IX51光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司)；脂多糖（LPS）（美國Sigma公司）提供；Nrf2 小干擾 RNA（siRNA)、鼠抗人Nrf2單克隆抗體（美國Santa Cruz生物科技公司）；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；一氧化氮合酶（iNOS）、TNF-α、IL-6、考馬斯亮藍(lán)染色法（Braford）蛋白含量檢測、Western blot檢測、全蛋白抽提檢測和SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組及模型制作 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對照組、ALI組、Nrf2干擾溶劑對照組（干擾溶劑組）和Nrf2干擾組4組，每組9只。Nrf2干擾組于尾靜脈注射Nrf2 siRNA 3mg/kg（溶于0.2ml干擾溶劑），而干擾溶劑組于尾靜脈注射等量干擾溶劑（1×PBS，溶解隨機(jī)序列siRNA），對照組和ALI組于尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)3d。第4天時，ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組腹腔注射LPS 10mg/kg（溶于0.2ml 0.9%氯化鈉溶液），制備內(nèi)毒素誘發(fā)ALI模型；對照組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。注射LPS或0.9%氯化鈉溶液6h后，配制10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉成功，再由腹主動脈取血，采用Gem premier 3000型血?dú)夥治鰞x進(jìn)行血?dú)夥治觯?jì)算氧合指數(shù)[PaO2/吸入氧濃度（FiO2）]，以氧合指數(shù)≤300mmHg為 ALI模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)[10]。36只小鼠由下腔靜脈取血，放血處死后，從胸腔中取出肺組織。

1.4 肺組織勻漿收集 取左肺組織用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿，制備為10%組織勻漿。取0.45ml 10%組織勻漿用于測定MPO；剩余組織勻漿用低溫離心機(jī)離心，10 000r/min離心10min，收集上清液置于-80℃保存，以備各項(xiàng)檢測用。

1.5 肺組織病理學(xué)觀察 取右肺副葉肺組織，0.9%氯化鈉溶液浸洗后，10%甲醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水置換、二甲苯透明后，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，Olympus IX51光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化，參照文獻(xiàn)[11]介紹的方法進(jìn)行肺組織病理學(xué)損傷評分：（1）肺泡腔及間隔中性粒細(xì)胞滲出：無滲出為0分，可疑滲出為1分，散在滲出為2分，滲出較多或呈小灶狀分布為3分；（2）肺泡間隔增寬：無增寬為0分，稍有增寬為1分，明顯增寬為2分，喪失正常肺泡結(jié)構(gòu)為3分；（3）肺泡腔出血：腔內(nèi)無紅細(xì)胞為0分，有少數(shù)紅細(xì)胞為1分，紅細(xì)胞較多為2分，紅細(xì)胞幾乎充滿肺泡腔為3分；（4）肺泡腔纖維蛋白滲出：無滲出為0分，少許滲出為1分，滲出較多為2分，幾乎充滿肺泡腔為3分。取4項(xiàng)評分之和為肺組織病理學(xué)損傷評分。每張切片隨機(jī)選取10個視野進(jìn)行評分，取其平均值。

1.6 測定濕重/干重比值 取右肺尖葉肺組織，稱濕重，置入80℃烘箱內(nèi)烘24h后稱干重，測定肺組織濕重/干重比值。

1.7 Nrf2核蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。小鼠肺組織勻漿用全蛋白抽提檢測試劑盒提取蛋白，Bradford法定量。取80μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入鼠抗人Nrf2單克隆抗體（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，次日TBST漂洗3次，加入二抗（1∶10 000稀釋）孵育后予以顯色，使用凝膠成像分析系統(tǒng)G:BOXChemiXR5成像，Gel-Pro32軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的條帶積分光密度值之比反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8 肺組織中MPO、iNOS水平檢測 按照試劑盒說明書，采用比色法檢測MPO、iNOS水平。

1.9 血清TNF-α和IL-6水平檢測 按照試劑盒說明書，采用ELISA法檢測血清TNF-α和IL-6水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織形態(tài)學(xué)變化 ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組肺組織切片炎癥反應(yīng)顯著，炎癥細(xì)胞浸潤肺泡間隔、肺泡腔，其中以中性粒細(xì)胞為主；支氣管壁增厚，可見肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大、肺泡間隔斷裂。上述3組中又以Nrf2干擾組炎癥反應(yīng)最明顯，而對照組未見上述炎癥反應(yīng)，見圖1（插頁）。與對照組比較，ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組肺組織病理學(xué)損傷評分升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與ALI組比較，Nrf2干擾組肺組織病理學(xué)損傷評分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

表1 4組小鼠肺組織病理學(xué)損傷評分比較（分）

2.2 4組小鼠肺組織濕重/干重比值比較 與對照組比較，ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組肺組織濕重/干重比值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與ALI組比較，Nrf2干擾組肺組織濕重/干重比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 2。

2.3 4組小鼠肺組織Nrf2核蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組肺組織Nrf2核蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與ALI組比較，Nrf2干擾組肺組織Nrf2核蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表2 4組小鼠肺組織濕重/干重比值比較

表3 4組小鼠肺組織Nrf 2核蛋白表達(dá)水平比較

2.4 4組小鼠肺組織MPO、iNOS水平比較 與對照組比較，ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組肺組織MPO、iNOS水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與ALI組比較，Nrf2干擾組肺組織MPO、iNOS水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4 4組小鼠肺組織M PO、i NOS水平比較

2.5 4組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 與對照組比較，ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組血清IL-6、TNF-α水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與ALI組比較，Nrf2干擾組血清TNF-α、IL-6水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表5。

3 討論

內(nèi)毒素誘發(fā)ALI在臨床中十分常見，往往也是多器官功能障礙發(fā)生的啟動原因。ALI一直是基礎(chǔ)及臨床研究中的重點(diǎn)及難點(diǎn)，總體臨床救治效果仍不理想，死亡率較高。其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，有待進(jìn)一步研究。本研究通過建立小鼠ALI模型，評價Nrf2對ALI的保護(hù)作用，以了解在ALI中Nrf2作為治療靶點(diǎn)的可行性，為找到有效的治療措施提供依據(jù)。

表5 4組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（pg/m l）

臨床上很多疾病都容易誘發(fā)內(nèi)毒素相關(guān)性ALI。本研究采用腹腔注射LPS 10mg/kg建立小鼠ALI模型，結(jié)果表明ALI組、干擾溶劑組和Nrf2組于注射LPS 6h后肺損傷評分和肺組織濕重/干重比值均升高，提示ALI制備成功。

本研究顯示LPS可增加肺組織Nrf2核蛋白表達(dá)，考慮與LPS能激活機(jī)體氧化應(yīng)激系統(tǒng)有關(guān)。而此期間肺組織損傷程度加重，說明內(nèi)源性免疫系統(tǒng)反應(yīng)升高Nrf2以對抗損傷，但是此保護(hù)作用不足以對抗此期間炎癥介質(zhì)的致?lián)p傷作用，故最終結(jié)果仍然顯示為肺臟損傷程度加重。本研究還發(fā)現(xiàn)，與ALI組比較，Nrf2干擾組肺組織Nrf2核蛋白表達(dá)水平下調(diào)，LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI嚴(yán)重程度加重，血清促炎癥因子水平和肺組織中氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)升高。提示Nrf2對ALI的保護(hù)作用與其抗炎和抗氧化作用有關(guān)。

Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化物表達(dá)的關(guān)鍵性因子，具有維持細(xì)胞氧化-抗氧化平衡、抑制凋亡及抗炎的多重生物活性。Nrf2與胞質(zhì)接頭蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）及ARE共同構(gòu)成Keap1-Nrf2-ARE通路[5]。Nrf2主要在代謝性器官、解毒器官以及與外界相通的器官中高表達(dá)，如腦、腎、肺和腸等[8-9,12]。正常生理狀態(tài)下，Nrf2定位于胞質(zhì)，與Keap1形成復(fù)合物，并由Keap1促進(jìn)Nrf2降解，使Nrf2維持在較低水平。當(dāng)機(jī)體存在氧化應(yīng)激反應(yīng)時，Nrf2磷酸化并從Keap1蛋白上解離出來，隨即活化轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合到ARE上，啟動其下游多個抗氧化基因及解毒酶等的轉(zhuǎn)錄翻譯，來對抗氧化應(yīng)激[5]。研究證實(shí)，經(jīng)NRF2信號通路調(diào)控的保護(hù)性基因數(shù)量龐大，這些保護(hù)性基因包含抗氧化蛋白類基因、Ⅱ相解毒酶類基因和抗炎因子類基因等。其中抗氧化蛋白類基因是這些保護(hù)性基因中非常重要的一類，包括超氧化物歧化酶、血紅素氧合酶1、依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶l等[13]。Nrf2可以抵抗炎癥刺激，抑制細(xì)胞組織受到炎癥損傷[8,14]。炎癥標(biāo)志物如IL-6、TNF-α等可用于炎癥疾病患者預(yù)后的評估[15]。

Lyu等[16]發(fā)現(xiàn)基因敲除Nrf2可以加劇小鼠膿毒癥器官損害程度，增加死亡率。Kim等[17]研究顯示，相對于野生型小鼠，Nrf2敲除小鼠ALI的損傷程度更重，提示Nrf2信號通路是ALI保護(hù)的關(guān)鍵位點(diǎn)。鄭丹等[18]發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸阻斷Nrf2-ARE通路可加重兔內(nèi)毒素休克誘發(fā)的ALI。本研究顯示，與ALI組比較，Nrf2干擾組肺損傷評分和肺組織濕重/干重比值升高，各氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)升高，提示Nrf2的表達(dá)對ALI有保護(hù)作用。

綜上所述，Nrf2通過抗炎和抗氧化功能對內(nèi)毒素誘發(fā)小鼠ALI時的機(jī)體起到保護(hù)作用。