人參皂苷Rg3通過內質網應激PERK通路抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤生長的研究

黃捷 吳可人 徐濤 金法 葉志鵬 閻九亮 李寧

膽囊癌是最常見的膽道惡性腫瘤之一，其致病原因尚不十分清楚，癥狀缺乏特異性，惡性程度高，進展快，轉移早且預后不良，確診時多屬晚期[1-2]，開發抑制其生長和轉移的藥物已成為一項重要課題。人參皂苷Rg3是從中藥人參中提取的單體成分，具有抑制腫瘤細胞生長、增殖，誘導腫瘤細胞凋亡的作用，并能選擇性抑制腫

瘤細胞轉移、浸潤及腫瘤新生血管的形成，還能明顯提高化療療效[3-4]。本課題組前期研究證實，人參皂苷Rg3在分子水平上調C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous transcription factor，CHOP）表達并激活 Caspase12 依賴性細胞凋亡，抑制CHOP表達能夠顯著減弱人參皂苷Rg3對膽囊癌細胞的細胞毒性和促凋亡作用[5]。本研究擬通過觀察人參皂苷Rg3對人膽囊癌細胞GBC-SD裸鼠移植瘤生長的作用，探討人參皂苷Rg3通過內質網應激雙鏈RNA依賴性蛋白激酶樣內質網激酶（pancreatic ER stress kinase，PERK）通路抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤生長的機制。

1 材料和方法

1.1 細胞來源 人膽囊癌細胞GBC-SD購自上海復祥生物科技有限公司，人膽囊癌細胞加入RPMI1640培養基中，放入37℃、5%CO2細胞培養箱培養。

1.2 實驗動物 5周齡雄性BALB/c裸鼠12只，體重約20～23g，購于常州卡文斯實驗動物有限公司，在浙江中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物房普通飼料喂養，自由飲水。

1.3 主要試劑和儀器 人參皂苷Rg3（美國Sigma-Aldrich公司，貨號：SML0184）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Scientific公司）；PERK抗體（英國Abcam公司）；磷酸化 PERK（p-PERK）抗體、β-actin 抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2 alpha，eIF2α）抗體（美國Proteintech 公司）；脂質運載蛋白 2（lipocalin 2，Lcn2）抗體、磷酸化 eIF2α（p-eIF2α）抗體、轉錄激活因子 4（activating transcription factor 4，ATF4）抗體（美國 Affinity Biosciences公司）；羊抗兔HRP標記二抗、羊抗鼠HRP標記二抗、RIPA裂解液（碧云天生物技術研究所）；Western blot實驗設備（美國Bio-Rad公司）；酶標儀（MK3，芬蘭雷勃公司）；成像系統（Tanon-5200，上海天能科技有限公司）；CO2細胞培養箱（美國Thermo Scientific公司）；倒置拍照顯微鏡（德國Leica公司）。

1.4 動物模型建立 采用隨機數字表法將裸鼠分為人參皂苷Rg3灌胃組和對照組各6只。取指數生長期人膽囊癌細胞GBC-SD，用PBS洗滌3次，重懸于PBS中并調整濃度為5×106/ml，于每只裸鼠右側腹股溝皮下注射0.2ml細胞懸液（1×106/個人膽囊癌細胞GBC-SD），細胞懸液接種7d后，觀察成瘤情況。待腫瘤長至50～70mm3開始進行灌胃處理，人參皂苷Rg3組將人參皂苷Rg3按20mg/kg劑量溶于0.2ml 0.9%氯化鈉溶液后灌

胃，對照組用0.2ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，連續給藥3周。

1.5 瘤體積和瘤體質量測量 灌 胃處理開始后每隔3d以游標卡尺測量腫瘤長、短徑并計算瘤體積直至第21天灌胃結束，瘤體積＝（腫瘤長徑×腫瘤短徑2）/2。21d后處死小鼠，切除腫瘤并稱重后，凍存組織以備后續實驗。

1.6 p-PERK、PERK、p-elF2α、elF2α、ATF4 和 L cn2 蛋白表達水平檢測 采 用Western blot法。取凍存組織按照RIPA裂解液說明書裂解，BCA法測定蛋白濃度，繪制標準曲線。灌制12%分離膠、5%濃縮膠的SDS-PAGE凝膠，樣品蛋白（25～40μg/樣品）通過 S DS-PAGE 電 泳，并轉移到PVDF膜，PVDF膜孵育在含5%脫脂奶粉的封閉液平皿中（室溫下30min）。將一抗稀釋至適當濃度（PERK、p-PERK、elF2α、p-elF2α、ATF4、Lcn2、β-actin稀釋度1∶1 000），加入封閉液中，4℃脫色搖床過夜，用TBST洗滌緩沖液在4℃下脫色搖床上洗滌，同上方法制備二抗稀釋液（1∶5 000），4℃下孵育 4 ～5h后，用 T BST洗滌緩沖液在4℃下脫色搖床上洗滌。加入ECL發光液，曝光后用Image J軟件分析，蛋白質的相對表達為每個蛋白與內參蛋白的灰度值的比值。

1.7 統計學處理 采 用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組裸鼠瘤體積和瘤體質量比較 人參皂苷Rg3灌胃組裸鼠瘤體質量明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。灌胃9d內，兩組裸鼠腫瘤體積大小比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；但灌胃12d開始，人參皂苷Rg3灌胃組裸鼠瘤體積較對照組均明顯減小，差異均有統計學意義（均P＜0.01），提示人參皂苷Rg3能抑制腫瘤體積增長，見表1。

2.2 兩組內質網應激PERK通路相關蛋白表達水平比較 人參皂苷Rg3灌胃組裸鼠p-PERK、p-elF2α、ATF4和Lcn2蛋白表達水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；但兩組裸鼠PERK和elF2α蛋白表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），提示人參皂苷Rg3能夠激活內質網應激PERK信號通路，見表2和圖1。

3 討論

研究表明人參皂苷Rg3能夠抑制多種腫瘤細胞的生長，但其作用機制尚不完全清楚[6-8]。本課題組前期研究表明，人參皂苷Rg3對原發性膽囊癌細胞具有顯著的細胞毒性和促凋亡作用，但是對非癌膽囊上皮細胞無影響[5]。該研究證實人參皂苷Rg3在分子水平介導的病理性內質網應激可能是其對膽囊癌細胞作用的關鍵機制。本研究則通過檢測人膽囊癌細胞裸鼠移植瘤組織中PERK 通路相關蛋白 p-PERK、PERK、p-elF2α、elF2α、ATF4和Lcn2的表達水平，探討人參皂苷Rg3對膽囊癌細胞PERK通路的作用，結果表明人參皂苷Rg3通過PERK、elF2α磷酸化，增加了下游蛋白ATF4、Lcn2表達，證實內質網應激PERK通路的激活，并發揮抗腫瘤作用。

表1 兩組裸鼠移植瘤體積與瘤體質量比較

表2 兩組裸鼠內質網應激PERK通路相關蛋白表達水平比較

圖1 兩組裸鼠內質網應激PERK通路相關蛋白表達的電泳圖

近年研究表明內質網應激PERK通路活化能夠誘導多種腫瘤細胞凋亡[9-11]。PERK通路是未折疊蛋白反應信號通路的一個組成部分。在非內質網應激狀態下，PERK與分子伴侶GRP78/Bip結合處于非活動狀態；在內質網應激條件下，PERK與GRP78/BiP分離并被激活，PERK磷酸化后引起eIF2α失活，使細胞多數蛋白質的合成終止，進而調節細胞周期。PERK、eIF2α磷酸化同時激活ATF4，上調CHOP表達[12]。ATF4是堿性亮氨酸拉鏈家族的成員之一，在內質網應激狀態下依賴PERK通路翻譯，在綜合應激反應通路的激活中起核心作用。在應激源作用下，eIF2α磷酸化后使ATF4進入細胞核內，激活下游基因表達[13]。在內質網應激相關內皮細胞凋亡的報道中均發現ATF4表達上調[14]。CHOP是內質網應激的一個特定轉錄因子，誘導內質網應激蛋白——細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因表達，與細胞周期調控相關[15]。此外，各類促細胞凋亡的研究中已有CHOP表達增加的相關報道[16]。

Lcn2也稱為中性粒細胞明膠酶蛋白，在多種實體腫瘤中均有表達上調，并被證明與腫瘤進展相關[17-19]。研究表明在前列腺癌細胞中未折疊蛋白反應通過NF-κB依賴途徑激活Lcn2表達，Lcn2在多種腫瘤細胞中表達可能伴隨未折疊蛋白翻譯活化，內質網應激/Lcn2可能是腫瘤發展過程中的一個潛在干預靶點[20]。另有研究表明在慢性腎功能不全時清蛋白通過升高胞質內鈣濃度，誘導未折疊蛋白反應，通過ATF4、Lcn2表達誘導腎小管上皮細胞凋亡；同時，Lcn2基因抑制能夠減輕內質網應激誘導的細胞凋亡，減輕蛋白尿小鼠的腎小管間質損傷，降低死亡率[21]。本研究也得出類似結果，人膽囊癌裸鼠移植瘤經人參皂苷Rg3處理后Lcn2蛋白表達顯著升高。

本研究表明人參皂苷Rg3灌胃能明顯抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤的生長，同時人參皂苷Rg3沒有增加PERK和eIF2α蛋白表達。人參皂苷Rg3灌胃組p-PERK、peIF2α、ATF4和Lcn2蛋白表達水平明顯高于對照組，表明人參皂苷Rg3能引起PERK、eIF2α磷酸化并增加ATF4、Lcn2蛋白表達，證實人參皂苷Rg3在體內激活PERK通路的重要作用，人參皂苷Rg3在體內通過激活內質網應激PERK通路，抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤生長。人參皂苷Rg3可以作為有前景的抗膽囊癌藥物進一步研究，而人參皂苷Rg3促膽囊癌細胞凋亡的其他機制有待進一步深入研究。