枯草芽孢桿菌NBF809防治番茄棒孢葉斑病研究

黃大野 曹春霞 張亞妮 王開梅 饒 犇 萬中義 周榮華 楊自文

（湖北省生物農藥工程研究中心，湖北武漢430064）

番茄棒孢葉斑病是由多主棒孢Corynespora cassiicola引起的一種重要病害，在世界多數番茄種植區域都有發生，近年來傳入我國，對我國番茄生產造成了嚴重的影響（Kodama & Hasama，1994；Schlub et al.，2009；李明遠，2015；杜公福 等，2017）。多主棒孢寄主廣泛，除了侵染番茄，還能侵染黃瓜和茄子等蔬菜以及花卉和橡膠等5 300余種植物，侵染破壞力強，傳播途徑廣，極易變異，導致其由次要病害上升為世界公認的主要病害（Smith et al.，2009；高葦 等，2011；李寶聚 等，2012）。

國內缺少相應的番茄抗性品種，化學防治仍然是防治棒孢葉斑病的主要手段。但該病菌極易產生抗藥性，目前已有其對苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、乙霉威和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑產生抗藥性的報道（Hasama et al.，1991；Date et al.，2004；Ishii et al.，2007；Miyamoto et al.，2009；Huang et al.，2013）。同時，化學殺菌劑的頻繁使用也會對人體健康和生態環境造成影響，因此亟須更為安全有效的防治方法。近年來應用芽孢桿菌作為生防菌防控真菌性和細菌性病害已經有大量報道，因其能有效預防和控制作物病害，被普遍認為是一種環境友好且安全有效的防治方法（K?berl et al.，2013）。

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisNBF809是由湖北省生物農藥工程研究中心分離和保存的具有高殺菌活力的菌株，前期研究表明其對多種植物病原菌有良好的抑制作用，本試驗研究其對番茄棒孢葉斑病的防治效果，以期為以后的田間示范和應用推廣奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枯草芽孢桿菌NBF809分離自番茄根際土壤。番茄棒孢葉斑病菌由湖北省生物農藥工程研究中心分離保存。50%啶酰菌胺水分散粒劑由德國巴斯夫公司生產。番茄品種為中雜109，中國農業科學院蔬菜花卉研究所選育。細菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，Marker D2000購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 離體對峙試驗

將NBF809菌株接種于LB液體培養基中，25℃、180 r·min-1振蕩培養18 h備用。番茄棒孢葉斑病菌經斜面活化到PDA平板5 d后，用打孔器打取4 mm菌餅接種于PDA平板中央，在距離菌餅25 mm處等距離取4個點接種NBF809，每點5 μL。以不接種NBF809作為對照，25 ℃培養6 d后觀察抑菌效果。刮取抑菌帶邊緣棒孢葉斑病菌菌絲，在顯微鏡（OLYMPUS CX21，Tokyo，Japan）下觀察其與對照菌絲的形態區別。

1.3 枯草芽孢桿菌NBF809對番茄棒孢葉斑病的防效

盆栽試驗于2017年7月在湖北省農業科學院玻璃溫室進行，播種催芽的番茄種子，在常規管理下培養30 d后備用。多主棒孢C. cassiicola孢子制備按照Miyamoto等（2009）的方法。將斜面保存的多主棒孢接種到PDA平板上活化并繼續進行擴繁，25 ℃黑暗培養10 d，隨后用無菌手術刀片刮去菌絲，在BLB（black light blue）燈下25 ℃培養3 d產孢（李寶聚 等，2012）。刷取孢子溶于無菌水中，利用血球計數板調整孢子濃度到1×104個·mL-1備用。

按照1.2的方法制備NBF809發酵液，調整芽孢數為1×108cfu·mL-1，噴施于番茄葉片表面至飽和，以50%啶酰菌胺水分散粒劑有效成分用量200 μg·mL-1為藥劑對照，噴施清水為空白對照。每處理3次重復，每重復32株番茄。24 h后噴施病原菌孢子懸浮液至葉片飽和，25 ℃保濕培養3 d，統計對照和各處理病情指數并計算防效。

病害分級按照Ishii等（2007）的標準。0級：無病斑，0.1級：病斑占葉面積＜1%，0.5級：病斑占葉面積1%～5%，1級：病斑占葉面積6%～10%，2級：病斑占葉面積11%～20%，3級：病斑占葉面積21%～30%，4級：病斑占葉面積31%～40%，5級：病斑占葉面積41%～50%，6級：病斑占葉面積51%～60%，7級：病斑占葉面積61%～70%，8級：病斑占葉面積71%～80%，9級：病斑占葉面積81%～90%，10級：病斑占葉面積＞90%。

病情指數=∑（各級植株數×級別）/（調查總株數×最高代表級別）×100

防治效果=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100%

1.4 NBF809菌株抗菌素生物合成基因的鑒定

以細菌DNA提取試劑盒提取NBF809菌株基因組DNA，通過PCR對NBF809菌株的抗生素生物合成基因進行檢測，共檢測23組基因（表1），合成 Bacillomycin D、Bacilysin、Ericin、Fengycin、Iturin、Mersacidin、Mycosubtilin、Sublancin、Subtilin、Subtilosin和Surfactin 11種抗菌素，引物序列和反應條件參考Chung等（2008）的方法。

1.5 數據處理

使用SAS 9.1.3軟件進行數據處理，在0.05水平下進行單因素差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 NBF809菌株對多主棒孢的離體抑制效果

NBF809菌株和多主棒孢對峙培養6 d后，病菌菌落和NBF809之間具有明顯的抑菌帶（圖1）。通過光學顯微鏡下（40倍）觀察，和對照菌絲相比，抑菌帶邊緣多主棒孢菌絲發生明顯的腫脹變形及扭曲（圖2）。

圖1 離體對峙培養結果

圖2 顯微鏡下NBF809對峙培養多主棒孢的菌絲形態

2.2 NBF809菌株對番茄棒孢葉斑病的防效

盆栽試驗結果表明（表2），施用1×108cfu·mL-1枯草芽孢桿菌NBF809發酵液對番茄棒孢葉斑病具有良好的防治效果，病情指數顯著低于清水對照，防治效果達到73.26%，對照藥劑50%啶酰菌胺水分散粒劑的防效最佳。

表1 聚合酶鏈式反應檢測NBF809抗菌素生物合成基因

2.3 NBF809菌株抗菌素生物合成基因的鑒定

通過23組抗菌素合成基因的篩選，對NBF809菌株產生抗菌素基因進行檢測，共檢測到5個合成抗菌素基因，分別為bacD、ituC、ituD、mrsM和mycC（圖3），所對應抗菌素為Bacilysin、Iturin、Mersacidin 和Mycosubtilin 。片段大小與預期相似，序列相似度均大于95%。

表2 枯草芽孢桿菌NBF809對番茄棒孢葉斑病的防效

圖3 合成抗菌素基因的擴增結果

3 結論與討論

本試驗結果表明，從番茄根際土壤分離到的枯草芽孢桿菌NBF809在溫室條件下對番茄棒孢葉斑病具有良好的防治效果。通過對代謝產物進行鑒定，發現其產生4種抗菌素，這些成分可能在病害防治中起到重要作用。除了抗菌代謝產物的分泌，其他的作用機制如誘導抗性、在番茄葉片的定殖能力等需要進一步確定（Ukness et al.，1993；Pieterse et al.，1998；Bais et al.，2004）。

枯草芽孢桿菌可以防治灰霉病、白粉病、枯萎病和稻瘟病等多種病害（陳志誼，2015），但在番茄棒孢葉斑病上的生物防治應用為首次報道。棒孢葉斑病極易產生抗藥性，NBF809菌株對于棒孢葉斑病抗性菌株的治理具有一定的作用，同時NBF809菌株與化學殺菌劑的混用有助于延緩殺菌劑對病原菌的抗性壓力，NBF9809菌株與化學殺菌劑的相容性、最佳配比及田間應用技術需要進一步研究。

本試驗開展了離體抑菌和活體盆栽試驗，由于芽孢桿菌在田間應用時會受到溫度、濕度、土壤、pH值等外界因素的影響（van Rij et al.，2004），因此其田間防治效果需要進一步進行評價。