聚乙烯亞胺增強Pluronic介導的BALB/c小鼠骨骼肌原位基因傳遞和表達效率

何雨桐， 孫哲， 王剛

(四川大學生物材料工程研究中心，成都610064)

人體骨骼肌分布廣、體積大且血管豐富，通過肌肉注射的方式將編碼功能蛋白的基因傳遞到骨骼肌細胞中，以之為“工廠”在患者體內“生產”治療性蛋白，實現個體化、精準化治療，是一種意義重大且前景廣闊的治療策略(Luetal.，2003a)。如何安全高效地將外源基因傳遞到肌肉細胞內表達是該策略成功的關鍵。盡管質粒DNA(pDNA)可以被傳遞到肌肉細胞中表達，但由于直接注射pDNA易被降解、入胞效率低等，轉染效率并不理想。因此，人們一直致力于開發各種基因傳遞策略來提高肌肉內基因傳遞和表達效率，如電轉移法、超聲法和載體介導法等(Miretal.，1998；Guérin，2000；Lauritzenetal.，2002；Luetal.，2003b；Wells，2004；Leeetal.，2012)。本文探究了陽離子聚合物——聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)作為基因載體，在骨骼肌原位基因傳遞體系中應用的可能性，利用PEI/pDNA復合物和Pluronic L64聯用構建了安全高效的基因傳遞體系(L/P/D)，其中，L代表Pluronic L64，P代表PEI，D代表pDNA。通過對不同氮磷比(N/P)的L/P/D體系介導的基因表達效率及體內生物安全性評估，揭示了N/P與肌肉內基因轉染效率的關系，并確立了PEI在骨骼肌內應用的有效方案。該方案為篩選和開發高效的、適用于臨床治療的骨骼肌原位基因傳遞系統提供了適當的原理和策略。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

5～7周齡體質量為20～25 g的BALB/c雄性小鼠若干，購于成都達碩生物科技有限公司[實驗動物生產許可證號：SYXK(川)2015-030]。動物實驗均在四川大學倫理委員會認可下進行，符合相關法規及制度[實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2013-017]。將小鼠在21 ℃、濕度45%～65%的環境中隨機分籠飼養。每組6只，所有小鼠均注射雙側小腿脛骨前肌。

1.2 試劑及儀器

支化聚乙烯亞胺25 kDa、Pluronic L64(Sigma-Aldrich，美國)；β-半乳糖苷酶(pCMV-LacZ)原位染色試劑盒(碧云天，中國)；E.Z.N.A.TM質粒小量提取試劑盒、PureLinkTM高純質粒大量提取試劑盒(Invitrogen，美國)；Luciferase Assay Kit(Promega，美國)；BCA蛋白分析試劑盒(Thermo，美國)。編碼β-半乳糖苷酶、熒光素酶(pCMV-Luc)和遠紅外熒光蛋白(pCMV-E2)的3種質粒由本實驗室劉益麗博士提供。ChemiDocTM XRS+凝膠成像系統(Bio-Rad，美國)；Varioskan Flash多功能酶標儀(Thermo，美國)；NanoS ZEN 1600型納米粒度及電位分析儀(Malven，英國)；NanoDrop 2000(Thermo，美國)；MFP-3D-BIOTM原子力顯微鏡(Bruker，美國)；In-VivoImaging System(CRI，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1質粒的制備與鑒定所有質粒在大腸桿菌EscherichiacoliDH5α中轉化擴增，并用上述提及的質粒提取試劑盒提取獲得。制備好的質粒用NanoDrop 2000測定濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，于-20 ℃短期保存，-80 ℃長期保存。

1.3.2肌肉原位注射操作配制各實驗組樣品，濃度為2 mg·mL-1的pDNA溶液與等濃度的PEI工作液按相應N/P混合，其中，DNA總質量為10 μg，室溫孵育20 min后形成N/P分別為0.5、3和10的PEI/pDNA復合物。隨后，取不同比例的復合物與10 μL 0.4%(W/V)Pluronic L64混合，用生理鹽水稀釋到40 μL，Pluronic L64終濃度為0.1%(W/V)，混合物室溫靜置5 min，形成L/P/D體系(L/P/D-0.5、L/P/D-3、L/P/D-10)，其中，L/P/D-0.5組代表PEI與pDNA的N/P=0.5，L/P/D-3組為N/P=3，L/P/D-10組為N/P=10。以生理鹽水組為陰性對照組，pDNA組為陽性對照組1，Pluronic L64/pDNA混合液(L/D)組為陽性對照組2。

小鼠7 d適應期后，其兩側脛骨前肌均被脫毛、消毒。用注射器分別吸取40 μL對照組溶液和實驗組溶液。肌肉注射時沿平行肌纖維方向進針約2 mm，2～5 s完成注射。

1.3.3報告基因檢測采用3種報告基因檢測體系分別從定性、定量以及基因表達持續性評估L/P/D體系：

(1)β-半乳糖苷酶定性檢測：對組織以原位染色的方式進行檢測，通過觀察著色范圍和顏色深淺判斷基因表達情況。按照β-半乳糖苷酶原位染色試劑盒說明書進行實驗，包括在冰上于染色固定液中固定20 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，固定的樣本進行染色處理2 h以上，最后用數碼照相機采集圖像。

(2)熒光素酶定量檢測：采用Luciferase Reporter Assay Kit試劑盒進行檢測。具體步驟包括：樣品經冰上勻漿、-80 ℃過夜裂解及4 ℃ 12 000 r·min-1離心3 min后，取20 μL上清液于不透光白色96孔酶標板中，用多功能酶標儀自動加樣并讀取吸光值。同時，采用BCA Protein Assay Kit進行樣品含量測定和均一化處理。標準品和樣品用酶標儀測定OD562下的吸光值，根據標準曲線方程計算出樣品中蛋白質含量，使用相對熒光素酶活性(RLU/mg Protein)表示結果。

(3)遠紅外熒光蛋白檢測基因持續表達情況：采用活體成像系統對肌肉原位注射后第7、14天后的紅色熒光蛋白E2-Crimson表達情況進行檢測。檢測前小鼠脛骨前肌脫毛處理，用黃光激發，在600～700 nm處掃描熒光信號，最后用儀器自帶軟件進行熒光成像分析。

1.3.4組織病理學檢測對注射后的肌肉組織和主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)切片進行染色及觀察，評估陽離子與Pluronic聯用的基因傳遞體系的生物安全性，為臨床使用提供依據。肌肉注射7 d后分離小腿脛骨前肌或尾靜脈注射4 d后解剖取出小鼠主要臟器，用PBS洗滌后放入4%(W/V)多聚甲醛固定液中固定48 h后，在乙醇和二甲苯溶液中進行梯度脫水。脫水后的樣品經過石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色處理后，用光學顯微鏡拍照。

1.3.5L/P/D-0.5體系中PEI/pDNA復合物的粒徑、電位及形貌表征3 μg或20 μg pDNA與濃度為100 ng·μL-1PEI工作液按相應N/P混合，室溫孵育20 min后用MilliQ水稀釋到1 mL。將裝有1 mL樣本溶液的1 cm石英比色皿放入馬爾文納米粒度及電位分析儀(Zeta-sizer，Malvern)中，通過動態光散射法(dynamic light scattering，DLS)對N/P為0.5時PEI/pDNA復合物的粒徑、分散性以及表面電位進行檢測，樣品DNA終濃度為3 μg·mL-1，每個樣品重復3次。將復合物吸附于云母片上并干燥后，使用原子力顯微鏡(AFM)表征其粒徑和形態學特征，樣品DNA終濃度為20 μg·mL-1。

1.4 統計學分析

采用Origin、Prism5.0對數據進行統計學分析，采用組間單因素方差(One-Way ANOVA)或t檢驗進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 β-半乳糖苷酶定性和熒光素酶定量分析

考察不同比例L/P/D體系對基因表達效率的影響，是應用陽離子材料構建高效的骨骼肌原位基因傳遞體系的關鍵。肌肉注射7 d后，在β-半乳糖苷酶(圖1：A)和熒光素酶(圖1：B)的表達水平上，L/P/D-0.5組的基因表達水平明顯高于陽性對照組1和陽性對照組2。然而，隨著N/P增加(L/P/D-3和L/P/D-10)，基因表達量開始明顯下降。從數值上看，L/P/D-0.5組介導的熒光素酶表達量是陽性對照組1的28.6倍、陽性對照組2的2.5倍。然而，當N/P增加到3和10時，幾乎檢測不到外源基因的表達，相比于其他組其數值減少了至少4個數量級。這些結果說明，只有在特定低的N/P時，PEI才能對該體系中的基因傳遞和表達產生積極的影響。因此，L/P/D-0.5為最優化的L/P/D體系。

2.2 熒光蛋白基因表達情況

在動物活體內持續考察外源基因表達，對于評估基因表達強度和持續性更有說服力(Puetal.，2014)。活體成像的結果顯示，陽性對照組1和L/P/D-0.5組的熒光信號能持續表達至少2周且未出現明顯衰減。L/P/D-0.5組的熒光信號明顯高于陽性對照組1 (圖2)。

2.3 組織學分析

肌肉注射7 d后，L/P/D-0.5組與陰性對照組的HE染色切片均未發現組織病變(圖3：a、b)，說明少量的PEI用于骨骼肌原位基因傳遞體系中是安全的。隨著N/P增加，L/P/D-3組顯示出肌纖維變性及炎細胞浸潤等病理變化(圖3：c)。當N/P達到10時，HE染色切片中出現大面積的炎癥細胞浸潤、淋巴細胞浸潤和肌纖維壞死等病理變化(圖3：d)。

圖1 L/P/D體系中肌肉內報告基因表達水平Fig. 1 Intramuscular expression of reporter genes in L/P/D system

肌肉注射7 d后， A.β-半乳糖苷酶表達， B. 熒光素酶活性； a. 陽性對照組1， b. 陽性對照組2， c. L/P/D-0.5組， d. L/P/D-3組，e. L/P/D-10組； 與陽性對照組1比較，*P<0.05

7 days after intramuscular injection， A. the image ofβ-galactosidase expression， B. the luciferase activity； a. positive control group 1， b. positive control group 2， c. L/P/D-0.5 group， d. L/P/D-3 group， e. L/P/D-10 group； compared with positive control group 1，*P<0.05

圖2 活體內原位熒光蛋白表達
Fig. 2Invivoexpression of thein-situfluorescent protein

尾靜脈注射4 d后，通過觀察主要臟器的組織切片，評估該體系的體內急性毒性。L/P/D-0.5組與陰性對照組的結果一致，未出現明顯的器官損傷(圖4)，說明與局部注射的結果一致，尾靜脈注射L/P/D-0.5不會造成臟器病變，進一步說明該體系具有良好的生物相容性。

圖3 不同比例的L/P/D體系中局部肌肉的組織學分析(蘇木精-伊紅染色，標尺=100 μm)Fig. 3 Histological analysis of local muscles in L/P/D systems with different N/P ratios (hematoxylin-eosin staining， scale bars=100 μm)

a. 陰性對照組， b. L/P/D-0.5組， c. L/P/D-3組， d. L/P/D-10組； 黃色箭頭為炎癥浸潤

a. negative control group， b. L/P/D-0.5 group， C. L/P/D-3 group， D. L/P/d-10 group； the yellow arrow shows inflammatory infiltration

2.4 L/P/D-0.5體系中復合物的表征

N/P為0.5的PEI/pDNA復合物(PEI/pDNA-0.5)的粒徑見圖5：A，該比例復合物具有納米尺寸[304 nm±7.6 nm，多分散系數(polydispersity index，PDI)=0.43]，且zeta電位為負(-15.9 eV±1.4 eV)，表明當N/P為0.5時，PEI與pDNA形成了納米尺寸的復合物粒子。通過AFM表征復合物的形貌特征，結果顯示，PEI/pDNA-0.5復合物具有近似球體的三維結構(圖5：B、C)。而AFM測定的粒徑結果顯示該復合物的粒徑在100～200 nm，這和動態光散射法的結果存在一定差異。

圖4 主要臟器的組織學分析(蘇木精-伊紅染色，標尺=100 μm)Fig. 4 Histological analysis of major organs (hematoxylin-eosin staining， scale bar=100 μm)

圖5 PEI/pDNA-0.5復合物的粒徑(A)和形貌特征(B、C)Fig. 5 Size (A) and morphologies (B， C) analysis of PEI/pDNA at N/P=0.5

A. 利用動態光散射儀測試的納米粒子粒徑及多分散性； B. 原子力顯微鏡(AFM)對納米粒子的形貌測試結果， 右側灰度靶表示粒子的高度； C. 利用AFM測試的納米粒子立體形貌圖

A. the particle size and polydispersity index of nanoparticles tested by dynamic light scattering instrument， B. the test results of atomic force microscope (AFM) on the morphology of nanoparticles， C. the three-dimensional morphology of nanoparticles tested by AFM

3 討論

骨骼肌原位基因傳遞和表達體系為基因治療提供了理想的策略，該體系的開放性允許將多種方法聯合應用，以獲得更好的治療效果。非離子型材料Pluronic可以提高基因傳遞效率，主要用于：(1)和病毒載體聯用以提高其安全性并增強基因轉染效率(Feldmanetal.，1997；Dishartetal.，2003)；(2)作為載體修飾基團(Jeonetal.，2003)或輔劑(Astafievaetal.，1996)改善陽離子非病毒載體在血清/生理環境中的穩定性并提高基因轉染效率；(3)單獨或與物理方法聯用，能顯著增強外源基因在肌肉原位基因傳遞體系中的傳遞/表達水平(Guérin，2000；Songetal.，2013；Liuetal.，2014)。Pluronic可能通過多種分子機制促進外源基因傳遞和表達，譬如，通過增強細胞膜通透性以增強pDNA、病毒載體或陽離子材料/DNA復合物的攝取(Gebhartetal.，2002)；促進pDNA在骨骼肌中的滲透、分布或入核作用等(Guérin，2000；Pitardetal.，2002)。在一種Pluronic L64介導的高效的骨骼肌內基因傳遞方案中，Pluronic L64利用相似的磷脂分子層結構與細胞膜相互作用，干擾其完整性，提高膜滲透性(Liuetal.，2014)。然而在該體系中，由于其Pluronic L64不與pDNA相互作用，未受保護的DNA在復雜的體內環境中容易被核酸酶降解，難以順利、安全傳遞到目標位點(Schmidtwolf & Schmidtwolf，2003)。與此同時，相比于被壓縮成納米級的核酸分子，未被壓縮的pDNA由于疏松的分子鏈狀態，其跨膜運動的效率會降低(Godbeyetal.，1999)。

一種常見的核酸保護策略是利用陽離子載體通過電荷作用對帶負電荷的核酸分子進行壓縮保護。支化聚乙烯亞胺作為一種公認的核酸載體被廣泛應用于體外基因轉染，展示出優異的轉染效果(Xuetal.，2009；Heetal.，2013)。然而，大多數體內實驗卻揭示了陽離子材料對肌內基因傳遞和表達的無效性甚至強烈的抑制作用(Trosetal.，2010；Songetal.，2013；Puetal.，2014)。這可能是由于體外細胞培養環境和復雜體內肌肉環境的不同所造成的(Ruponenetal.，1999)。細胞外基質(extracellular matrix，ECM)中大量帶負電荷的分子能結合帶正電荷的PEI/pDNA復合體，從而干擾復合物向肌肉細胞內的傳遞，極大地降低了肌內基因傳遞效率并引發嚴重的組織炎癥(Pitardetal.，2004；Burke & Pum，2008)。因此推測，帶負電荷或電中性的材料/pDNA復合物能避免與ECM中電負性分子的非特異性結合，可能適合于肌內基因傳遞體系。在PEI與pDNA的復合體系中，通過調節陽離子PEI與pDNA的比例，制備出帶有不同表面電荷的復合物。因此，本研究希望找到一個合適的PEI與pDNAs的比例，使之形成整體帶負電荷的復合物，從而避免與ECM中帶負電荷分子的相互作用，同時，降低PEI用量也可以減輕甚至避免局部炎癥反應等，這些都可能有利于目的基因向肌肉細胞中的傳遞和表達。本實驗結果證實，只有L/P/D-0.5組可以明顯提升外源基因表達水平，并能在監測時間范圍內維持高水平表達，當N/P增加，L/P/D介導的基因表達急劇下降，甚至低于陽性對照組1。同時，無論是肌肉原位注射還是尾靜脈注射，L/P/D-0.5均表現出很好的生物相容性，能夠安全適用于骨骼肌基因傳遞以增強外源基因的表達水平，而提高N/P肌肉組織會有不同程度的病理變化，特別是高N/P時(N/P=10)。上述基因表達水平和生物安全性的數據與預期結果一致，證明在特定的低比例條件下，PEI/pDNA復合物的電負性特征的確有助于構建高效安全的骨骼肌原位基因傳遞/表達體系。值得一提的是，這個比例在體外基因轉染實驗中完全無效，體外轉染細胞時，N/P在10～15為最佳轉染條件。這也表明了體內外基因傳遞所需條件截然不同，這可能與體內外細胞所處環境不同有關。

由于PEI完全壓縮DNA時的N/P為3(Daietal.，2011；Dai & Wu，2012)，因此，N/P為0.5時，復合物中的DNA并不能被完全壓縮，但少量PEI的加入已使DNA的結構變得相對緊密，形成了具有一定三維形態且帶負電荷的納米復合物。雖然由2種檢測手段檢測出的復合物粒徑有所差異，其誤差可能是不同的制樣條件導致的。AFM圖像反映的是干燥后的納米粒子的三維結構，而DLS則需要納米粒子在溶液狀態時測定(Lietal.，2001)。我們推測，在L/P/D-0.5體系中，PEI/pDNA復合物的電負性特征使其免于被滯留于ECM中，有利于其向細胞內的傳遞；兩親性Pluronic L64分子利用其與細胞膜的相似性而擾動并提高細胞膜的通透性(Chenetal.，2015)，為復合物分子進入細胞創造了有利條件；PEI壓縮pDNA形成了結構較為緊密的復合物分子，更有利于其穿過通透性增高的細胞膜，并抵御了核酸酶的降解。這些條件使L/P/D-0.5體系的傳遞和表達效率超過了質粒和單純Pluronic L64介導的體系，達到了一個新的高度。

本研究以BALB/c小鼠為模型，驗證了一個重要概念：將pDNA壓縮成帶負電荷的納米復合物粒子，能夠應用于并提高Pluronic L64介導的骨骼肌原位基因傳遞和表達水平。這一概念的驗證，為如何促進DNA/材料復合物分子進入骨骼肌細胞提供了一個解決之道，對構建更加高效的原位基因傳遞/表達體系將產生推動作用，由此可以設計更合適的材料分子壓縮DNA，進一步提高外源基因表達水平，甚至可能將該體系推進到應用水平。事實上，在本項研究中，一次性肌注后，紅色熒光蛋白在小鼠骨骼肌細胞中持續穩定的高表達，已經展示了該體系對一些長期、慢性病變的應用前景。