飼料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的測定

易建希

摘要：試驗建立了飼料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的高效液相色譜測定方法。飼料中的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星用乙腈-磷酸鹽緩沖液（pH7.0）提取，混合型陽離子固相萃取柱凈化，氨化甲醇溶液洗脫.0.025mol/L磷酸溶液（三乙胺調pH至3.0）：甲醇：乙腈（82：7：11）作為流動相，C18色譜柱進行分離，檢測波長為287nm。結果表明，在0.5～50.0μg/mL濃度范圍內線性關系良好，r=0.999。該方法的檢測限為1.0mg/kg，定量限為5.0mg/kg。本法操作簡單，結果準確，可用于飼料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的測定。

關鍵詞：洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星;飼料;高效液相色譜法

1 引言

2015年9月中華人民共和國農業部發布公告決定在食品動物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥（中華人民共和國農業部公告第2292號）。公告內容：為保障動物產品質量安全和公共衛生安全，我部組織開展了部分獸藥的安全性評價工作。經評價，認為洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑可能對養殖業、人體健康造成危害或者存在潛在風險。根據《獸藥管理條例》第六十九條規定，我部決定在食品動物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥，撤銷相關獸藥產品批準文號。因此本文建立了高效液相色譜方法對飼料中的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星進行測定。

2材料與方法

2.1試劑與材料

除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T 6682規定的一級水。磷酸二氫鉀;氫氧化鈉;甲醇：色譜純;乙腈：色譜純;磷酸：色譜純;三乙胺：色譜純;氨水：提取液：磷酸鹽緩沖溶液（取磷酸二氫鉀6.8g，加水使溶解并稀釋至500mL，用5.0mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.0）375mL與125mL乙腈混勻;氨水一甲醇溶液：將30mL氨水與70mL甲醇混合均勻;對照品：洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星（純度≥98%）;對照儲備液：精確稱取對照品50mg（精確到0.1mg），用0.03mol/L氫氧化鈉溶液溶解并稀釋，該溶液濃度為1.0mg/mL;對照工作液：準確移取適量對照儲備液，用流動相配成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0μg/mL; 0.22μm微孔濾膜;混合型陽離子固相萃取柱（60mg/3 mL）。

2.2儀器與設備

高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）：分析天平：感量0.00001g和0.001g;固相萃取裝置;旋渦混勻器;離心機;恒溫振蕩器;氮吹儀。

2.3液相色譜條件

檢測波長：287nm;色譜柱：C18柱，5μm，250mm*4.6mm;流動相：移取1.7mL磷酸用水稀釋至1L，三乙胺調pH至3.0，并按82：7：11的比例和甲醇、乙睛混合，用前超聲脫氣5min;流速：1.0mL/min;進樣量：20μL。

2.4樣品前處理

準確稱取試樣2.0g，置于50mL具塞離心管中，準確加入10.00mL提取液，振蕩搖床振蕩15 min。置于離心機中15000r/min離心10min，取上清液備用。用3mL甲醇、3mL水活化固相萃取柱，準確移取5.00mL備用液過柱，用3mL水、3mL甲醇淋洗，真空抽干。3mL氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，于50℃下氮氣吹干。準確移取1.00mL流動相溶解殘留物，渦旋混合1min，過微孔濾膜后，供高效液相色譜分析。

2.5標準曲線的繪制

將分別配制為0.5，1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/mL的標準工作液，分別注入色譜儀，測定各濃度工作液的峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

2.6靈敏度的測定

稱取5份配合飼料各2.0g，按樣品處理方法測定，測得基線噪音值，按3倍信噪比計算，求得該方法的檢測限。

2.7 回收率的測定

稱取空白配合飼料2.0g，分別添加一定量的標準工作液，使得添加濃度分別為1.0，5.0，10.0mg/kg，每一濃度的樣品設置5個重復，按樣品處理方法測定，用外標法根據峰面積計算其含量和添加同收率。

3結果

空白飼料、陽性添加飼料、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星對照品溶液的液相色譜見

3.1標準曲線

在選定的條件下，做定量校準曲線。以洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的濃度對峰面積繪制標準曲線，結果見表1，表明洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星在0.5～50.0μg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系。

3.2方法的檢測限

該方法測定洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的檢測限為1.0 mg/kg，定量限為5.0mg/kg。

4討論與分析

4.1波長的選擇

由洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星在分光光度計的掃描圖可知，洛美沙星、氧氟沙星最佳吸收波長為287nm，培氟沙星、諾氟沙星最佳吸收波長為278nm。在278nm波長處洛美沙星、氧氟沙星吸收值與培氟沙星、諾氟沙星吸收值相差較大，而在287nm波長處培氟沙星、諾氟沙星吸收值與洛美沙星、氧氟沙星吸收值相差較小，因此確定最佳檢測吸收波長為287nm。

4.2流動相的選擇

洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星呈堿性，具有較強的極性，其在反相色譜上保留時間比較好控制。采用反相色譜時有機相的比例對洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的保留影響比較大，選擇合適比例的有機溶劑是很必要的。甲醇的洗脫能力低于乙腈，因此選擇乙腈作為有機相。隨著流動相中乙腈比例的加大，洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的保留時間降低。但單獨使用乙腈作為有機相時，等度或梯度流動相中氧氟沙星、諾氟沙星出峰時間重疊，無法分離，所以用部分甲醇代替乙腈，作為有機相組成。為了避開色譜圖中氧氟沙星、諾氟沙星峰重疊的干擾，試驗比較了多種不同甲醇、乙腈組成比例的色譜圖，結果發現采用流動相組分為82%磷酸溶液：7%甲醇：11%乙腈的比例時，可有效洗脫洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星，并分離氧氟沙星、諾氟沙星組份，從綜合效率考慮此流動相組成比例為最佳。

4.3提取溶劑的選擇

試驗中采用了0.1mol/L氫氧化鈉溶液.磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0），0.1mol/L鹽酸溶液;0.025mol/L磷酸-三乙胺溶液（pH3.0），等作為提取溶液。通過試驗比較各種溶液的回收率，磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）提取液能較好的減少雜質對提取飼料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的影響，但同收率較低。為提高回收率，所以在提取液中加入乙腈，經過比較從5%～50%乙腈比例，得出25%乙腈比例回收率最佳。

4.4凈化條件的選擇

洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星為堿性化合物，難溶于其他有機溶劑，通過比較HLB、C18、PCX、AluminumN、SCX、MCX、MAX 等固相萃取小柱的回收率和凈化效果，最終確定選擇回收率高，凈化效果好的混合型陽離子固相萃取柱進行凈化。

5結論

采用高效液相色譜檢測技術測定飼料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星含量的檢測方法，在飼料中添加濃度為1.0，5.0，lO.Omg/kg時，測得洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的平均回收率分別為60.0%～95.0%，變異系數分別為1.0%～8.8%，各組分的檢測限為1.0mg/kg，定量限為5.0mg/kg。方法具有較好的靈敏度、準確度和精密度，定量限符合相關規定。

高效液相色譜法有“高壓、高速、高效、高靈敏度、應用范圍廣”的特點，最低一級基層實驗室均可滿足本方法的實驗條件，具有很高的推廣價值。但由于紫外檢測器本身的局限性，導致在檢測的過程中，可能存在假陽性的問題，就需要使用更高級的質譜或者串接質譜檢測器來做精確辨別。

參考文獻（略）