混合型飼料添加劑中1，8 -桉葉素和松油烯-4-醇含量檢測方法研究

林茂發 黃永輝 胡朝陽 黃何何 高希

摘要：建立了同時檢測茶樹油混合型飼料添加劑中1，8-桉葉素和松油烯-4-醇含量的氣相色譜方法。樣品采用乙醇提取，經毛細管相色譜柱（ZB-35，30m×0.32mm×0.25um）分離，氫火焰離子化檢測器測定，外標法定量，并采用氣質確證。方法學研究結果表明，目標化合物1，8-桉葉素和松油烯-4-醇在0.01～10 mg/mL濃度范圍內具有良好線性關系，相關系數為r≥0.9990，檢出限分別為15mg/kg、10mg/kg;回收率為80.8～102.5%，相對標準偏差為2.23～4.57%。該方法簡便、快捷，靈敏度和準確度均較高可以用于茶樹油混合型飼料添加劑樣品中1，8-桉葉素和松油烯-4-醇的測定。

關鍵詞：茶樹油;混合型飼料添加劑;1，8-桉葉素;松油烯-4-醇;氣相色譜法;氣質確證

養殖戶在養殖過程中由于動物的疾病等原因可能使用各種抗生素，抗生素對動物的疾病等有一定的治療效果，但是長期大量不合理使用會產生負作用。一方面經常喂養抗生素會破壞動物體腸道的有益菌群并使動物體內產生耐藥菌株形成抗藥性，降低動物的免疫能力，增大治療和養殖難度。另一方面，抗生素類藥物及其代謝物在動物體內經過富集.會導致畜禽魚體產品獸藥殘留超標，近年來檢測出的蛋類、畜禽肉類、魚肉中抗生素及其代謝物超標，究其原因均為養殖戶不合理使用抗生素引起的，畜禽魚肉產品抗生素及其代謝物殘留量一般極低，但長期食用，會對人體健康產生危害。因此開發新型的、高效、保障養殖產品安全、能夠替代抗生素的飼料添加劑，對推動養殖業向健康養殖、無抗養殖，提高養殖產品安全，滿足人們對食品安全需求，具有積極的意義。

經過多年的養殖實踐表明，采用植物提取物或中藥作為飼料添加劑對動物體不會產生毒害與殘留及生抗藥性而且可促進動物肌體生長，能夠改善畜禽魚肉的品質，可以長期拌料喂養，提高畜禽魚的免疫力，采用養防并舉，實現養殖業綠色，高效，環保可持續發展。目前，飼料添加劑企業利用我國植物及中草藥豐富的資源大力開發植物提取物和中藥類型的功能型飼料添加劑以取代抗生素的使用，養殖戶也逐漸接受無抗養殖的理念。相對于市場上種類繁多的新型飼料添加劑，質量監管部門能提供的檢測方法標準顯得有些不足，因此，有必要加強該類新型飼料添加劑檢測方法的開發與研究。

本實驗研究對象為以互葉白千層茶樹（MelaleucaAlternefolia Tea Tree）枝葉為原料生產的茶樹油（Tea Tree oil，TTO）為活性物，以玉米淀粉為載體，以豆油（或同類型的植物油）為稀釋劑按一定比例均勻混合制成的混合型飼料添加劑產品。茶樹油是一種天然的植物提取精油，在日化、食品、醫藥、生物農藥等方面有廣泛的應用。由于茶樹油具有廣譜抗微生物，抑菌、殺菌、消炎、驅蟲等功能，用于飼料添加劑可以治療動物的某些疾病，提高動物的免疫能力，降低餌料系數及改善畜禽魚肉的品質，是農業部《飼料添加劑品種目錄（2013）》允許使用的飼料添加劑之一，是種替代抗生素的理想飼料添加劑。茶樹油組成成分較為復雜，已經研究發現的化學分子有100多種，按照主要特征組分組成可分為三種類型，分別為：松油烯-4-醇型（松油烯-4-醇≥30%）、1，8-桉葉素型（1，8-桉葉素≥35%）和異松油烯型（異松油烯≥40%），國內市場上應用的主要為4-松油醇型和1，8-桉葉素型，我國茶樹油作為飼料添加劑在養殖領域的應用已經有一定的研究，但對茶樹油飼料添加劑的檢測方法尚未見文獻報道，本實驗開發出氣相色譜法（GC-FID）同時檢測茶樹油飼料添加劑中的特征組分松油烯-4-醇（terpinen-4-olcas no 562-74-3）和1，8-桉葉素（1，8-Cineolecas no 470-82-6）的檢測方法，并對目標化合物采用氣相色譜串聯質譜法（ GC/MS）確證，實驗證明該方法準確快捷，可以用于茶樹油飼料添加劑的檢測。

1 實驗部分

1.1儀器與設備

氣相色譜儀帶自動進樣系統聯FID檢測器及配套丁作站（日本SHIMADZU公司），石英毛細管柱（ZB-35，30m×0.32mm×0.25um）美國Agilent公司.6890N/5973N氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司;ZB-35MS石英毛細柱（30m×0.25mm×0.25μm）美國Agilent公司，BT224S分析天平，德國Sartorius公司;XH-B旋渦混均器，江蘇康健醫療用品有限公司;調速多用振蕩器（上海研永超聲設備有限公司）;高速冷凍離心機，Aanti J-E，美國BeckmanCoulter公司：具塞玻璃刻度管（10毫升，25毫升兩種規格）;50ML具塞塑料離心管。

1.2材料與試劑

甲醇、乙醇、乙腈、丙酮均為分析純，1，8-桉葉素標準品純度大于99.0%（德國Dr.Ehrenstorfer公司），松油烯-4 -醇標準品純度大于98%（德國Dr - Ehrenstorfer公司）。稱取一定量的標準品，用無水乙醇溶解轉移到容量瓶中，并逐級稀釋成實驗所需的的濃度。再配制成相應濃度的混標。

1.3方法

1.3.1色譜條件：進樣口溫度：260℃;色譜柱升溫程序：50℃保留1min，10℃/min升至250℃，保留10min。檢測器（FID）溫度280℃，載氣，氮氣（純度不小于99.999%）;燃氣，氫氣（純度不小于99.99%）;空氣（壓縮空氣）;氣體流量：柱流量，1.85mLmin;氫氣40mL/min;空氣400mL/min;尾吹氣，30mL/min;進樣量：1μL;分流比：50：1。

1.3.2樣品前處理

準確稱取樣品1克（精確至0.0001g），置于塑料離心管中，用4ml無水乙醇旋渦混均溶解后，在振蕩器上振搖3min后，于5000r/min條件下離心5 min，吸取上清液于玻璃刻度管中，重復上述操作一遍，再加入2ml無水乙醇重復上述操作一遍，定容，搖勻，置于-18℃條件下速凍1小時，過0.45um有機相濾膜后，上機檢測。

1.3.3測定

在上述選定的氣相色譜條件下，待儀器穩定后，進行標準溶液和試樣溶液氣相色譜分析。

2結果與分析

2.1 色譜方法條件的選擇

分別取空白基質樣品、茶樹油混合飼料添加劑樣品按上述前處理方法制備的溶液及混合標準品溶液，按1.3.1色譜條件測定。結果發現空白基質樣品在目標化合物保留時間處無雜質峰干擾，見圖二，圖三和圖四，表明樣品基質中其他成分不干擾目標化合物測定，并且能夠在最短的時間實現目標化合物完全分離，方法特異性強，適用于茶樹油混合型飼料添加劑中1，8-桉葉素和松油烯一4-醇含量測定。

2.2方法的線性范圍及檢測限

將1，8-桉葉素、松油烯-4-醇系列標準溶液（0.01mg/ml～10.00mg/ml）加入空白基質中，在上述的氣相色譜條件下進樣分析，以標準溶液濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，擬合標準曲線，得到相應的線性同歸方程及相關系數，根據3倍噪比計算方法的檢測限，以10倍信噪比計算方法定量限。結果見表1

2.3 方法的回收率和精密度

向空白基質樣品中分別添加Ⅰ（Sg/kg）、Ⅱ（10g/kg）、Ⅲ（50g/kg）三個濃度水平的混合標樣，每個水平進行6次平行測定，同收率和精密度結果見表2。

2.4溶液穩定性試驗

按上述的前處理方法制備樣品溶液，樣品溶液密封保存在室溫環境中，隔2h、4h、8h、12h、24h、48h按前述方法測定（1，8-桉葉素1.00g/kg，松油烯-4-醇29.00g/kg）的含量，結果見表3，結果表明樣品溶液在48h內穩定。

2.5 色譜柱的選擇

影響色譜柱分離效果的一個重要因素是固定相類型，目標化合物的化學結構和極性是本實驗主要考慮的因素，茶樹油型飼料添加劑是以茶樹油為活性物，以玉米淀粉為載體，以豆油（或同類型的植物油）為稀釋劑按一定比例均勻混合制成的。因此選擇色譜柱除了要考慮1，8-桉葉素、松油烯-4-醇的分子結構外，還要考慮茶樹油和其它基質的干擾因素。本實驗采用了3種不同極性的色譜柱，ZB-5、ZB-35及ZB-624毛細管色譜柱，綜合考慮靈敏度，峰形，分析時間，基線漂移等色譜分析因素，ZB-35毛細管色譜柱效果最好，因此以ZB-35毛細管色譜柱作為本試驗用色譜柱。

2.6柱溫和柱流量的優化選擇

由于茶樹油除了1，8-桉葉素和松油烯-4-醇外還有其它的眾多組分，有些組分和目標化合物的出峰時間較接近，在確定優選色譜柱后，氣相色譜法中能夠影響目標化合物分離效果的因素主要為色譜柱的升溫程序和色譜柱的氣體流量。本研究反復實驗比較了不同的初始溫度、升溫速率、柱流量后，確定儀器參數為：進樣口溫度：260℃;色譜柱升溫程序：500℃保留1min，10℃ /min升至250℃，保留10min。檢測器（FID）溫度280℃。氣體流量：柱流量，2.00mL/min;氫氣48mL/min;空氣480mL/min;尾吹氣，30mL/min。

2.7提取溶劑的選擇

本研究實驗采用了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮作為樣品的提取溶劑，實驗表明丙酮提取物雜質較多，對目標化合物的定性容易生產的干擾。而甲醇，乙醇、乙腈這3種溶劑均能很好地提取目標化合物，由于乙醇較其他溶劑毒性小，價格便宜，對環境無毒害，所以本研究實驗選擇無水乙醇作為提取溶劑。

3 GC/M確證

在空白基質中添加濃度為10g/kg水平的混標，按1.3.2進行前處理。

質譜條件：載氣為高純氦氣，流速為2.0ml/min;采用分流進樣，分流比為50：1;進樣口溫度為260℃，初始溫度為50℃，以10℃/min升至200℃保持10min，離子源為EI源;電子能量為70eV;傳輸線溫度270℃;離子源溫度230℃;四級桿溫度150℃;溶劑延遲3min。采用Scan掃描模式，m/z質量掃描的范圍為50～500 m/z。總離子流圖和質譜圖見圖五和圖六。

4實際樣品測定

對企業生產的茶樹油混合型飼料添加劑進行測定，準確稱取樣品1克（精確至0.0001g），按1.3.2進行前處理。采用GC-FID測定，色譜譜圖見圖七，測定結果與產品明示值相符。

5結論

本研究建立了茶樹油混合型飼料添加劑中1，8-桉葉素和松油烯-4-醇的氣相色譜法測定方法，能夠實現簡單的樣品前處理和高通量檢測，方法特異性強并且具有較寬的線性范圍，十分顯著的線性關系、加標回收率高、重現性好的優點;使用儀器設備普及率高，可在茶樹油混合型飼料添加劑中1，8-桉葉素和松油烯-4-醇的質量檢測及標準制定中加以推廣應用。

參考文獻（略）