油污土壤修復微生物的篩選及其影響因素

慕慶峰, 于立紅, 張 濤, 賈洪柏, 吳慧云

(1.黑龍江八一農墾大學 農學院 寒地作物栽培技術省級重點實驗室, 黑龍江 大慶 163319;2.中海油能源發展股份有限公司 工程技術分公司, 天津 300452; 3.東北林業大學, 生命科學學院, 黑龍江 哈爾濱 150040)

石油作為重要的化石能源為社會的發展提供了巨大的動力，但是，自20世紀以來，石油污染帶來的問題日益突出[1]，石油進入土壤后，會對土壤、植物、微生物、水體等產生直接或間接危害，如堵塞土壤孔隙，使土壤透水、透氣性降低，改變土壤有機質的碳氮比和碳磷比，引起土壤板結[2]；進入土壤的石油會附著在植物根系表面，影響根系的呼吸和吸收作用，抑制植物生長，并且大多數石油污染物具有致癌、致畸和致突變作用[3]，危害人類的身體健康。傳統處理油污土壤多采用的是熱解析、化學洗滌方法[4]，因費用昂貴，產生二次污染，處理后土壤不能復墾等不足，難以規模化應用。而微生物原位修復技術因其良好的修復效果，低廉的價格，無二次污染等特點越來越成為全世界有機污染修復的主流技術[5]。該技術通過優化環境因素來加速自然生物降解進程，是一種高效、經濟和生態可承受的綠色清潔修復技術[6]。其技術核心是獲得高效微生物及其影響因素之間的作用關系，尋找到最佳的組合方式，提高土壤中石油污染物的降解[7]。微生物作為環境修復的主體，其降解效率決定修復水平。提高降解率的第一要務是獲得高效石油降解菌[8]。因此篩選高效降解菌成為國內外行業、學術界研究熱點。不同種屬微生物都有自己底物譜系，單一微生物很難獨立完成修復任務，特別是面對石油這種超級復雜有機物復合體，更需要偏利共生的高效微生物種群協同降解。因此開展高效協同菌種的篩選及其修復影響因素研究具有重要意義。本文針對大慶地區石油污染的土壤篩選馴化高效石油降解協同微生物菌群，并在室內開展模擬試驗，研究微生物原位修復的主要影響因素及水平(正交設計)之間的關系，以期為石油污染場地生物修復工程的參數設計提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌 源

在大慶油田不同類型的油污地采集油污土壤，均勻混合，轉入塑料袋中，密封，4 ℃低溫保藏，用于菌種的篩選，石油樣品來自大慶油田采油一廠。

1.2 培養基

(1) 固體篩選培養基。石油20 g/L; NH4Cl 6 g/L; K2HPO45 g/L;微量元素液8 ml; KH2PO45 g/L;瓊脂20 g/L;蒸餾水1 L;調整pH值至7.0～7.2。

(2) 增殖培養基。NH4Cl 6 g/L; K2HPO45 g/L;KH2PO45 g/L;葡萄糖20 g/L;微量元素液8 ml;蒸餾水 1 L。

(3) 石油降解培養基。NH4Cl 6 g/L; K2HPO45 g/L;微量元素液8 ml，KH2PO45 g/L，蒸餾水1 L，石油1 g/L,pH=7.0～7.2。

(4) 微量元素液。MgSO44 g/L; MnSO410 g/L; FeSO4·7 H2O 10 g/L; CaCl210 g/L; ZnSO410 g/L;去離子水1 L。

1.3 菌株篩選

1.3.1 菌株初篩 稱取10 g油污土壤樣品，放入250 ml錐形瓶中，用生理鹽水定容至100 ml，放入10個玻璃珠，170 r/min振搖，待土壤分布均勻，取1 ml泥水混合液用無菌生理鹽水梯度稀釋后，分別移取10-6，10-5，10-4倍的混合稀釋液0.5 ml至相應編號的固體篩選培養基平板內，用三角刮刀均勻涂布，倒置放入30 ℃恒溫培養箱中進行培養。觀察菌種生長情況，挑取長勢良好的菌落再次梯度稀釋，并接入到石油篩選培養基中進行培養。重復上述步驟，直到得到純培養的石油烴降解菌。純培養菌種4 ℃冰箱保藏備用。

1.3.2 菌株的石油降解能力測定 將保藏菌株接入到增殖培養基中,30 ℃,140 r/min振蕩培養48 h，7 000 r/min離心，菌體以2質量數接入到250 ml三角瓶中，每瓶含液體石油降解培養基(1.2.3)50 ml，30 ℃，140 r/min震蕩培養7 d后，加入20 ml石油醚(餾分30～60 ℃)萃取(重復3次)，合并有機相，并將水相7 000 r/min離心10 min，取上清液至分液漏斗，加入10 ml石油醚振蕩100次，靜置，待分層后收集合并總有機相，68 ℃蒸干，置干燥器中冷卻至恒重，稱重。不接菌的培養液為對照，按照下列公式計算石油降解率(μ)(3次重復)。

μ=(W0-Wx)/W0×100%

(1)

式中：W0——對照液中殘余石油含量(%)；Wx——菌培養液中殘余石油含量(%)。

1.3.3 菌群的復配研究 石油是一種復雜的混合物，每種微生物只能降解特定的組分，優勢微生物只能在特定時期在油污土壤環境中占據頂端優勢，為提高石油降解率，研究復合菌群降解石油的協同能力至關重要[9]。試驗選擇石油降解率高，在土壤擴散能力強的菌株進行復配，測定7 d石油降解率。真菌生長環境偏酸、細菌偏堿，因此本次試驗按照真菌間互作，細菌間互作，真菌細菌混作原則，等比例接入菌量，每個試驗真菌按總濕菌量1 g接入，細菌則接入1 ml發酵液(提前調到1 012 cfm)。測定方法參照菌株的石油降解能力測定法，初始石油濃度1 g/L,(7 000 r/min離心發酵液獲得)，3次重復。

1.4 復合微生物菌群正交試驗設計

土壤的營養條件、含水率、pH值、石油的組分及濃度決定著土壤中微生物組成和數量的變化，后者直接關系到油污土壤的修復效果，為明晰其關系，試驗選取5個因素：土壤石油污染強度；營養物(NH4NO3，K2HPO4)[10]；氧化劑(H2O2溶液)[11]；表面活性劑[12]和接菌量[13]，每個因素設4個水平，比較不同因素影響下油污土壤的微生物修復效果，探求修復效果最好的外源補給方案，試驗選在室內進行，溫度25 ℃，適當補充水分，兩次重復。各因素及其水平列表L16(45)見表1。

培養條件：10 kg土壤放入50 cm×40 cm×35 cm的塑料箱中，土壤深度35 cm,用黑色塑料布封好

表面，定期翻整土壤。試驗中,分別于第7，14，21，28，35，42，49 d對土壤進行檢測，測定石油降解率。根據預試驗中獲得的菌種在土壤不同深度的生長狀態，將土壤分為上中下3層，每次取樣分別在上(0—10 cm)、中(11—25 cm)、下層(26—35 cm)隨機用土壤環刀等比例取土，樣品烘干、粉碎、混勻后通過4分法取土10 g，用石油醚萃取，然后測定和計算石油降解率。

表1 研究區正交設計試驗因素及水平

注：表1中各因素不同水平劃分的標準為：A為原油占原土重的質量百分比；B為原油/N/P的比例,其中N源為NH4NO3，P源為K2HPO4；C為H2O2占原土重的質量比(g/kg)；D為表面活性劑占原土重的質量百分比；E為接菌量(發酵液)占土重的百分比。下同。

2 結果與分析

2.1 石油降解菌株的初篩

經篩選馴化，共獲得16株原油降解效果好的菌株，3株真菌(DPF1，DPF2，DPF4)和13株細菌(DPB001-DPB013),其中DPB009為含油廢水中分離得到的菌株。參照1.3.2方法對所得菌株進行石油降解率的測定，菌株形態特征及石油降解情況如表2所示。

表2 菌株形態特征及石油降解情況

2.2 降解菌群的復配

考慮到嗜油微生物在土壤中擴散能力，選擇全部3株真菌(DPF1，DPF2和DPF4)和降解率最高的兩株細菌(DPB004和DPB009)進行復合菌群協同試驗，2株真菌(DPF2和DPF4)混合菌群的7 d石油降解率達到87.77%，遠遠高于普通降油菌對石油類的降解率(40.3%～57.6%)[14]和海洋細菌對石油類的降解率(40.89%～62.75%)[15]。

向量的下標和上標分別表示向量的某個元素和該向量在某次迭代時的值,如xi和x(j)分別向量x的第i個元素和向量x在第j次迭代時的值.矩陣的下標和上標分別表示矩陣的行向量和列向量,如Ai和Aj分別表示矩陣A的第i個行向量和第j個列向量,而Aij則表示矩陣A的第i行第j列元素.向量x和矩陣A的轉置分別表示為xT和AT.向量x∈Rn的l2范數記為矩陣A∈Rm×n的Frobenius范數記為核范數記為其中r為矩陣A的秩,σi為其第i個奇異值.

如圖1所示，采用LSD法對各處理兩兩比較，真菌(DPF2和DPF4)比單一真菌DPF2試驗組高5.88%，比真菌DPF4試驗組高7.32%，說明真菌DPF2和真菌DPF4具有偏利共生，二者代謝底物有不重合域，不重合域越大，協同能力越強。細菌亦如此，對單一細菌DPB004試驗組和DPB009試驗組而言，兩株細菌混合試驗組降解率更高，但是在搖瓶培養條件下細菌和真菌混合后的降解率不高，說明此降解條件下細菌和真菌的協同效果不理想。考慮細菌在土壤中活動受限制，在接下來的試驗中主要研究這2株真菌的復合菌群對油污土壤的修復。

注：不同小寫字母表示在p<0.05水平下差異顯著，不同大寫字母表示在p<0.01水平下差異顯著。

圖1研究區微生物復配試驗

2.3 復配菌系正交試驗設計

如表3所示，試驗設計采用5因素4水平正交設計,共16個試驗組。按照1.4方法定期取樣測定石油降解率，用SPSS軟件17.0分析所得數據。結果顯示對7 d各試驗組石油絕對降解量進行分析如表4所示。

表3 研究區各采樣時間石油降解率 %

注：石油降解率=石油絕對降解量/初始油污土壤含油量×100%。

表4 研究區石油的7 d降解率SPSS分析

從表4結果方差分析,均值大的因素水平影響效果強，各因素水平對結果影響的強弱順序為:A2>A1>A2>A3,B1>B4>B3>B2,C4>C3>C2>C1,D4>D3>D1>D2,E4>E2>E3>E1。方差分析給出因素水平比較,在本次統計中,A，B，C，D，E5個因素都當成了處理因素,這種試驗設計實際上沒有考慮試驗誤差，即表中Error 為0。在正交設計中，如果沒有重復試驗，又無空白項時，常取因素離均差平方和(Ⅲ 型平方和)最小項作為誤差估計[16]。從表5中可以看出,A的Ⅲ 型平方和SSC=68.251最小,它對整個試驗結果影響最小,因而把它作為誤差估計,用以檢驗其他因素作用的顯著性。這樣重新進行統計,方法同上,只是不要將變量A添加參與到計算即可[17],結果見表4。

極差分析可知,因素的F值越大,其影響權重越高，各因素對試驗結果的重要次序為:D>C>B>E>A,氧化劑(C)對石油降解率影響水平極顯著性，p<0.05水平，氧化劑(C)對石油降解率C1和C4影響水平極顯著，表面活性劑(D)在p<0.05水平，水平1水平2和水平4差異顯著，污染強度(A)、營養物(B)、接菌量(E)在7 d內對石油降解率影響非常小,綜合各種因素,確定石油降解因素組合為D4C4B1E4A2。同理可得14，21，28，35，42，49，56 d的各因素重要次序和最佳工藝，見表5。

表5 研究區正交設計試驗各因素重要性

對表5數據進行分析，為了清楚整個修復過程因素動態變化，現對數據進行圖形化處理，以時間為橫坐標，因素重要性為縱坐標。例如把因素的重要性分為5級，與排序相反，以7 d因素A為例，A重要級別為縱坐標,即為1同理因素D為5，畫折線圖。考慮折線的平滑性以及因素的均值大小對表5因素重要性進行校正，數據如圖2。

圖2 研究區各因素對生物修復的重要性

從圖2可知：因素A污染強度在0～7 d內權重為1級，即對生物修復影響最小，8～28 d權重為3級，35～49 d權重最低降至1級。分析原因，微生物進入土壤后，有一個生物延遲期，微生物調整底物代謝的酶系統。污染強度在0～28 d內對降解率有影響。可見在一定條件內，微生物可利用的石油組分越多，石油絕對降解量越大，但對整個修復期間降解率的影響不顯著。因素B營養物：在0～7 d內權重3級，微生物處于生理延遲期，細胞需要緊急啟動新底物代謝酶系統，因此對氮磷過量積累。而14～28 d,權重降為1級，可能跟土壤固有營養供給和前期過量吸收短時間需求量不大有關；土壤固有營養消耗殆盡后，外加補給作用更加明顯，因此35 d后權重升為4級。如圖2在整個修復過程，因素B水平2出現5/6次(扣掉微生物遲緩期第一星期)，所以因素B2為最佳比例。

氧化劑C在前21 d內響應指數一直為4級，28 d后權重升為5級，說明氧化劑C在整個修復過程中都具有重要影響，添加氧化劑在整個修復期內都具有重要意義。考慮H2O2是一次添加，7 d內全部消耗掉了，因此只要不產生微生物生理毒性，氧化劑濃度大有好處，因此因素C4為最佳比例。

表面活性劑D在0～21 d權重為5級，影響最大，可見生物修復初期石油乳化效果對生物降解至關重要。28 d后權重降為1級，分析原因：初期外加表面活性劑促進了微生物的增殖，后期大量生物表面活性劑的產生，降低了外源表活劑的權重。因此表面活性劑D4為最佳配比。

接菌量E在前42 d為2級，后期升級為3級，在整個修復期因素E水平均值差異不顯著，因此接菌量的多寡決定不了降解效果，即對降解率影響不顯著，因此E2比較適合。

3 討 論

根據圖2可知：在整個56 d降解期間內，C因素氧化劑均占較大的權重，其對降解率影響最大。原因是化學氧化使大分子底物分解為小分子，提高了生物可降解率。但也有研究表明，氧化劑濃度過高會對微生物產生毒害作用[18]，因此氧化劑添加要有合適濃度，在本試驗確定C4為適合氧化劑濃度。D因素表面活性劑具有增溶作用，石油為非極性物質，具有疏水性，而微生物表面具有親水特性，添加的表面活性劑能增加石油與微生物之間的接觸機會，提高石油污染物質的可利用性，縮短土壤修復時間；而本試驗因素C在0～21 d內權重最大，證明了上述觀點。隨著外加的表面活性劑被微生物降解[19]，其權重逐漸降低。到56 d時，D因素的權重已降至最小，證明表面活性劑大量被微生物消耗(表面活性劑一次性投入，不在不加)；另一方面到了降解后期微生物自身能夠大量產生生物表面活性劑，所以到了后期D因素對降解的影響權重自然變小。相比之下，E因素接菌量在整個修復期權重最小(除0～7 d延遲期)，推測其原因是微生物超強的自我繁殖能力，微生物數量的大量增殖，降低了因素E接菌量的影響，導致本試驗微生物接菌濃度水平對于石油降解率影響很大，試驗數據處理方差均值不顯著也證明了此觀點。

4 結 論

(1) 本試驗從石油污染樣品中，以石油為唯一碳源進行篩選、分離得到石油降解菌株16株，選取5株高效降解菌作進一步協同試驗。其中包含3株真菌(DPF1，DPF2，DPF4)和2株細菌(DPB004，DPB009)，這些株菌均能使石油乳化。經復配研究，真菌(DPF2，DPF4)協同效果較好，7 d石油降解率可達87.77。

(2) 采用真菌(DPF2，DPF4)的復合菌群，設計5因素4水平的正交試驗室內模擬微生物修復油污土壤的試驗。結果表明，在56 d內，石油污染強度為10的油污土壤降解率最高，達94.12%，石油污染強度為25的油污土壤，降解率為90.17%。

(3) 采用SPSS統計軟件17.0對降解過程進行分析，發現在21 d內，表活劑影響權重第一，氧化劑權重第2。21 d后氧化劑權重上升為第1，表活劑權重逐漸降低，營養劑則在28 d后上升至第2位置。石油烴污染強度僅在35 d前有一定權重(影響)，在修復后期影響最小。在整個修復過程，接菌量在所有因素中方差均值都最小，對降解率權重(影響)不大。