黃連素對脂多糖誘導(dǎo)小鼠血小板減少模型的保護(hù)作用

董亮 王淼 許華 王兵 王勇強(qiáng)

1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院（天津 300070）；2天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（天津 300193）；3天津市第一中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科天津市急救醫(yī)學(xué)研究所（天津 300192）

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為革蘭陰性菌細(xì)胞壁特有的組成成分，覆蓋于細(xì)胞壁的最外層，是一種常見的病原相關(guān)分子模式識別配體［1］。LPS被細(xì)菌釋放入血后可與機(jī)體相應(yīng)細(xì)胞上的受體結(jié)合誘發(fā)炎癥反應(yīng)，在膿毒癥發(fā)病過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。血小板減少（thrombocytopenia，TCP）是膿毒癥常見的并發(fā)癥，研究表明血小板減少程度與膿毒癥患者預(yù)后相關(guān)，膿毒癥并發(fā)TCP是預(yù)后不良的重要標(biāo)志［2］。因此，有效地緩解膿毒癥并發(fā)TCP患者的血小板減少程度對此類患者的預(yù)后有很大的幫助。黃連素又稱小檗堿（berberine，BBR），是一種從祖國傳統(tǒng)中藥黃連、黃柏等中藥植物中提取出來的生物堿［3］。研究報道顯示其具有較突出的抗炎作用，且能夠在一定程度上抑制血小板聚集及LPS引起的炎癥反應(yīng)，然而其對膿毒癥相關(guān)性血小板減少的作用尚未見報道［4-5］。本研究擬用單次腹腔注射LPS法制備小鼠TCP模型，并隨機(jī)分組分別給予不同劑量的黃連素處理，觀察黃連素對脂多糖誘導(dǎo)小鼠TCP模型是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級健康雄性C57BL/6小鼠100只，8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，證書：SCXK（京）2014-0004，于（25±2）℃，濕度45%～55%，每日光照8 h條件下飼養(yǎng)，期間自由飲水、進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)之前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2主要試劑脂多糖（LPS）、黃連素（BBR）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA·2Na）（北京索萊寶科技有限公司），TNF-α ELISA試劑盒、IL1-β ELISA試劑盒、IL18 ELISA試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司），小鼠CD41抗體、辣根過氧化物標(biāo)記的二抗（BD Biosciences），蘇木素染液（佰思諾（天津）生物科技有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)分組、造模及給藥將100只小鼠隨機(jī)分為5組：空白對照組（C組）、LPS模型組（LPS組）、LPS+低劑量BBR組（L組）、LPS+中劑量BBR組（M組）、LPS+高劑量BBR組（H組），每組20只。其中治療組給予不同劑量黃連素灌胃（低劑量BBR組給予5 mg/kg BBR，中劑量BBR組給予25 mg/kg BBR，高劑量給予50 mg/kg BBR），每天1次，連續(xù)3 d；第3天灌胃后3 h，LPS組及BBR干預(yù)組根據(jù)體重單次腹腔注射終濃度為25 mg/kg的LPS，以制備小鼠血小板減少模型，空白組根據(jù)體重給予腹腔注射適當(dāng)?shù)纳睇}水。

1.4小鼠一般狀況及生存率的觀察在LPS注射后觀察各組小鼠的飲食、排便等一般狀況及72 h內(nèi)的死亡情況。

1.5小鼠外周血血小板參數(shù)及炎癥因子的測定分別于LPS注射后0、2、6、24 h，于小鼠目內(nèi)眥采血30 μL，EDTA抗凝后全血細(xì)胞分析儀測血小板計數(shù)（PLT）、血小板壓積（PCT）、血小板寬度（PDW）和平均血小板體積（MPV）；分別于LPS注射后0、2、6、24 h，于小鼠目內(nèi)眥采血300 μL，取上清，用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β和IL-18的表達(dá)情況。

1.6免疫組化檢測各組小鼠肺組織血小板滯留情況于LPS注射24 h取血后，頸椎脫臼處死小鼠，取肺臟組織，10%福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋并切片，脫蠟、抗原修復(fù)后加3%過氧化氫溶液室溫避光孵育25 min，PBS脫色洗滌3次，BSA封閉30 min，小鼠CD41抗體，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，二抗室溫孵育50 min，PBS洗滌3次并用DAB顯色，蘇木素復(fù)染、沖洗，脫水封片，觀察并分析結(jié)果。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法分別應(yīng)用SAS軟件、SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對不同時間點(diǎn)的多次測量資料采用重復(fù)測量方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法比較組間生存率，多組間比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性檢驗(yàn)采用LSD檢驗(yàn)方法，方差不齊時采用Dunnett′s T3檢驗(yàn)方法。計量資料以表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1BBR對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠一般狀況的影響在LPS注射24 h時觀察各組小鼠的一般狀況，發(fā)現(xiàn)對照組小鼠活動量正常，對外界刺激反應(yīng)迅速，毛發(fā)光澤，飲食、排便情況正常，眼部無充血、粘連、潰爛等情況。LPS處理組小鼠表現(xiàn)出無活動，對外界刺激反應(yīng)力遲鈍或無反應(yīng)，身體卷軀，聚集成堆，寒戰(zhàn)，嗜睡，毛發(fā)暗淡、豎立，眼結(jié)膜充血、分泌物增多甚至粘連、潰爛，飲食量下降，大便稀溏。BBR干預(yù)組小鼠表現(xiàn)為活動量減少，對外界刺激反應(yīng)力減弱或遲鈍，毛發(fā)雖暗淡，但眼結(jié)膜無充血及分泌物，飲食量亦下降，但大便成形偏軟或干燥，整體表現(xiàn)較LPS組有所改善。

2.2BBR對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠生存率的影響通過觀察各組小鼠72 h內(nèi)的生存率，結(jié)果顯示C組、M組、H組72 h生存率為100%；LPS組72 h內(nèi)生存率為60%，48 h內(nèi)生存率為70%，24 h內(nèi)生存率為90%；L組72 h內(nèi)生存率為80%，48 h內(nèi)生存率為80%，24 h內(nèi)生存率為100%。提示，M組、H組生存率高于LPS組，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.71，P=0.03）（圖1）。

圖1 BBR對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠生存率的影響Fig.1 Effect of BBR on the survival rate of LPS-induced TCP mice

2.3BBR對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠外周血血小板參數(shù)的影響分別收集LPS注射后0、2、6和24 h的外周血并檢測血小板參數(shù)，結(jié)果顯示，除C組外，其余各組從0～24 h，外周血中PLT和PCT均逐漸下降，且與C組相比，LPS組、L組、M組、H組在2、6、24 h的PLT和PCT均明顯降低，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.001）。其中PLT結(jié)果分析顯示，與LPS組相比，M組、H組在2、6、24 h的PLT高于LPS組（P＜0.001）。L組在2 h的PLT高于LPS組（P=0.002），L組在6、24 h的PLT與LPS組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。L組在2、6、24 h的PLT低于M組、H組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。H組在6 h的PLT高于M組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004），但在2、24 h的PLT兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2A）。PCT結(jié)果分析顯示，LPS組僅在24 h的PCT顯著低于M組和H組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.047，P=0.02）；其余時間點(diǎn)，L組、M組、H組的PCT與LPS組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖2B）。PDW和MPV檢測結(jié)果顯示，從2、6到24 h，除C組外，其余各組的PDW和MPV均逐漸升高，且與C組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.001）。但BBR干預(yù)組與LPS組組間及BBR干預(yù)組組間PDW值相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2C）。與C組相比，LPS組、L組在2、6、24 h的MPV均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001）；而M組與H組在6 h和24 h時的MPV值與C組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但BBR干預(yù)組與LPS組組間及BBR干預(yù)組組間MPV值相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2D）。

2.4BBR對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠外周血炎癥因子表達(dá)的影響通過對LPS注射后各時間點(diǎn)小鼠外周血血清中TNF-α、IL-1β和IL-18表達(dá)情況的檢測，結(jié)果顯示：在LPS注射后，除C組外，其余各組的TNF-α、IL-1β和IL-18表達(dá)量均隨觀察時間的延長而降低，且與C組相比，其余各組的TNF-α、IL-1β和IL-18水平在LPS注射后2、6、24 h均顯著增高（P＜0.001，其中H組在24 h的IL-18水平較C組高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義）；與LPS組相比，M組、H組在2、6、24 h時各因子水平明顯低于LPS組（P＜0.05或P＜0.01），L組在2 h時各因子水平明顯低于LPS組（P＜0.05或P＜0.01），在6 h時，TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平低于LPS組（P＜0.05），在24 h時，各因子水平與LPS組相比均無顯著差異（P＞0.05）（圖3）；在LPS注射后2、6、24 h，L組的各因子水平均顯著高于M組與H組（P＜0.05或P＜0.01），而M組的TNF-α的表達(dá)水平在6 h和24 h時高于H組（P＜0.001）（圖3A），其IL-1β的表達(dá)水平在2 h和6 h時顯著高于H組（P＜0.05）（圖3B），而IL-18的表達(dá)水平在2 h、6 h、24 h均顯著高于H組（P＜0.05或P＜0.01）（圖3C）。

圖2 全血細(xì)胞分析儀檢測BBR對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠外周血血小板參數(shù)的影響Fig.2 The effect of BBR on the peripheral blood platelet parameters of TCP mice induced by LPS by whole blood cell analyzer

圖3 ELISA試劑盒檢測BBR對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠外周血炎癥因子表達(dá)的影響Fig.3 ELISA kit for detecting the effect of BBR on the expression of inflammatory cytokines in peripheral blood of TCP mice induced by LPS

2.5BBR對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠肺臟血小板滯留的影響通過收集小鼠肺臟組織并對其進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果顯示：模型組小鼠肺臟組織中CD41的IOD值均顯著高于空白對照組（P＜0.01），BBR干預(yù)組小鼠肺臟組織中CD41的IOD值均顯著低于LPS組（P＜0.01），L組IOD值高于M組、H組（P＜0.01）；M組、H組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）（圖4）。

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測BBR對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠肺臟血小板滯留的影響Fig.4 Immunohistochemical method for detecting the effect of BBR on LPS-induced lung platelet retention in TCP mice

3 討論

膿毒癥是由感染引起的反應(yīng)失調(diào)而出現(xiàn)致死性的器官功能障礙，是危重癥患者死亡的主要原因之一［6］。血小板減少則是膿毒癥患者常見的并發(fā)癥，研究表明血小板減少程度與膿毒癥患者的預(yù)后不良具有相關(guān)性［7］。膿毒癥伴血小板減少患者的病情通常較不伴血小板減少的患者更重，雖然隨著醫(yī)療科技及高效綜合管理的不斷更新，膿毒癥患者的病死率已有所改善，但膿毒癥相關(guān)性血小板減少的發(fā)病機(jī)制仍未闡明，人們對膿毒癥相關(guān)性血小板減少患者的治療仍需進(jìn)一步的研究和改進(jìn)。

黃連素作為傳統(tǒng)中藥，由來已久，古書記載其不僅具有清熱解痛、除胎毒、防斑疹的作用，還具有清滌血熱，去心之惡血之療效。近年來研究［8］表明，黃連素具有一定的抗內(nèi)毒素作用，能抑制LPS的促凝血作用，但黃連素對LPS誘發(fā)的血小板減少尚未見報道。為探究黃連素是否對LPS誘發(fā)的血小板減少有影響，本研究采用了黃連素預(yù)處理小鼠及野生小鼠用LPS單次腹腔注射法誘導(dǎo)小鼠TCP模型，觀察記錄各組小鼠的一般狀況及72 h內(nèi)的生存率并檢測LPS注射后小鼠外周血中血小板各項(xiàng)參數(shù)和炎癥因子的變化情況，以及收集小鼠肺臟組織檢測肺臟內(nèi)血小板的滯留情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃連素能夠在一定程度上緩解LPS給小鼠帶來的傷害，能夠有效地改善LPS刺激后小鼠的生存率。血小板參數(shù)檢測結(jié)果提示黃連素能夠抑制LPS誘導(dǎo)的血小板減少，并且黃連素的這一作用呈劑量依賴性。除此之外，黃連素還可抑制LPS誘發(fā)的外周血中TNF-α、IL-1β、IL-18水平的升高，在一定程度上緩解機(jī)體的炎癥反應(yīng)。肺組織免疫組化結(jié)果提示黃連素能夠減少LPS誘發(fā)的血小板在肺臟中的滯留，并且還能夠在一定程度上改善LPS引起的肺損傷。這些觀察、檢測結(jié)果均表明黃連素對LPS誘發(fā)的小鼠TCP模型具有一定的保護(hù)作用，黃連素可通過抑制LPS引起的血小板減少、炎癥反應(yīng)以及血小板在肺臟中的滯留來減輕LPS對小鼠機(jī)體帶來的損傷，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。