UFLC法同時測定厚樸中4個活性成分的含量

關 皎，于洋洋，馮 波，朱鶴云

(吉林醫藥學院藥學院，吉林 吉林 132013)

厚樸始載于《神農本草經》，列為中品，原文記載“厚樸主中風，傷寒，頭痛，寒熱，驚悸氣，血痹，死肌，去三蟲”。2015版《中國藥典》記載厚樸(MagnoliaeOfficinalisCortex)為木蘭科植物厚樸MagnoliaoffcinalisRend. et Wils.或凹葉厚樸MagnoliaoffcinalisRend. et Wils. var.bilobaRehd. Et Wils.的干燥干皮、根皮或枝皮，具有燥濕消痰，下氣除滿的功效[1]。厚樸為我國傳統中藥材，主要分布于四川、湖北、浙江、貴州、湖南等地區。厚樸中主要含有酚類、生物堿類、苯丙醇苷類、揮發油類成分，其中和厚樸酚與厚樸酚為厚樸中兩種代表性酚類成分，木蘭花堿為厚樸中代表性生物堿類成分，紫丁香苷為厚樸中代表性苯丙醇苷類成分[2]?，F代研究表明，和厚樸酚與厚樸酚具有抗菌、消炎、抗腫瘤、肌肉松弛、抗焦慮、降膽固醇和抗衰老等作用[3]，木蘭花堿具有抗炎、抗氧化、免疫抑制、抗菌等作用[4]，紫丁香苷具有抗炎、鎮痛、降血糖、免疫調節、保肝等作用[5]。2015年版《中國藥典》僅將和厚樸酚與厚樸酚作為厚樸藥材質量控制的指標性成分，采用高效液相色譜法測定其含量，難以全面控制其內在質量。近年來，超快速液相色譜(Ultra-fast liquid chromatography, UFLC)技術由于在峰容量、分離效率、靈敏度方面均優于常規 HPLC，并可在極短的時間內達到柱平衡或重新平衡，顯著減少分析時間，減少溶劑消耗，已越來越多的應用于中草藥成分分析研究[6-7]。本研究首次采用超快速液相色譜法同時測定厚樸中和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿和紫丁香苷的含量，所建立的定量分析方法分析時間短，分析效率明顯提高，可為厚樸的質量評價提供科學依據，同時為天然藥物應用于獸醫獸藥領域提供參考。

1 儀器與試藥

Prominence UFLC型超高快速液相色譜儀(配備Prominence SIL-20AHT自動進樣器，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-20A紫外檢測器，LC solution色譜工作站，日本島津公司)；XK96-A快速混勻器(江蘇新康醫療器械有限公司)；KQ-250DE型數控聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA 225D型電子天平(德國賽多利斯儀器有限公司)；粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

甲醇和乙腈為色譜純(美國Fisher科技)，所用水為經過Milli-Q型超純水儀凈化后的超純水，其他試劑均為分析純。對照品和厚樸酚(批號：110730-201614)、厚樸酚(批號：110729-201714)、紫丁香苷(批號：111574-201605)，購自中國食品藥品檢定研究院，對照品木蘭花堿(批號：17020802)，購自成都普菲德生物技術有限公司，純度均大于98%。厚樸藥材，購自吉林市吉林大藥房，產地為四川省，經吉林醫藥學院生藥教研室李景華副教授鑒定為木蘭科植物厚樸Magnoliae Officinalis Cortex的干燥干皮、根皮或枝皮，樣本留存于吉林醫藥學院藥學院中藥樣品室。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制 取和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿、紫丁香苷對照品適量，精密稱定，置5 mL容量瓶中，用甲醇配成質量濃度分別為1.0、1.0、0.1 mg/mL和0.1 mg/mL的單一成分對照品儲備液，置于4 ℃冰箱內保存備用。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取厚樸藥材粉末0.2 g(過40目篩)，置50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱重，超聲(功率250 W，頻率50 kHz)處理30 min，冷卻至室溫，稱重，用甲醇補足減失的重量，振搖均勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，精密量取續濾液5 mL，置25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，振搖均勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件 采用日本島津公司Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm, 2.2 μm)，預柱為日本島津公司C18保護柱(4 mm×3.0 mm，2.2 μm)，流動相為0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～7 min，20%B；7～7.1 min，20%→78%B；7.1～16 min，78%B)，平衡時間為2 min，流速為0.4 mL/min，檢測波長為265 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為5 μL。和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿和紫丁香苷用于含量測定的典型色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)、樣品(B)色譜圖1：木蘭花堿(Magnoflorine)； 2：紫丁香苷(Syringin)；3：和厚樸酚(Honokiol)； 4：厚樸酚(Magnolol)

2.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.1”項下的各對照品儲備液適量，置于同一5 mL量瓶中，用甲醇-水(20∶80，v/v)配制成木蘭花堿與紫丁香苷質量濃度均為0.2、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL，和厚樸酚與厚樸酚質量濃度均為2、5、10、25、50、100 μg/mL的系列混合對照品溶液；取混合對照品溶液200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上，按“2.3”項下條件依次進樣測定色譜峰面積，以對照品質量濃度X(μg/mL)為橫坐標，色譜峰面積積分值(Y)為縱坐標，進行線性回歸，結果和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿、紫丁香苷的線性回歸方程分別為：Y=2.314×104X-1.281×104，R=0.999 9；Y=2.089×104X-9.021×104, R=0.999 8；Y= 2.417×104X-1.083×103, R=0.999 9；Y=3.124×104X-7.905×102, R=0.999 9；上述4個成分質量濃度分別在2～100、2～100、0.2～10、0.2～10、μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.4”項下制備的和厚樸酚質量濃度為25 μg/mL，厚樸酚質量濃度為25 μg/mL，木蘭花堿質量濃度為2.5 μg/mL、紫丁香苷質量濃度為2.5 μg/mL的混合對照品溶液 200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上。按上述色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。結果和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿、紫丁香苷峰面積的RSD分別為0.6 %、0.4%、0.7 %、0.6%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取同一份供試品溶液200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上，在室溫下分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12 h和24 h 進樣測定，記錄峰面積。結果和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿、紫丁香苷峰面積的RSD 分別為2.4%、2.7%、1.8%、2.8%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.7 重復性試驗 取同一批厚樸藥材樣品6 份，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液；取供試品溶液200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上，進樣測定，記錄峰面積，計算待測成分的含量。結果和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿、紫丁香苷的含量平均值(n=6)分別為1.63%、2.20%、0.229%、0.207%，RSD分別為2.7%、2.6%、1.0 %、2.7%，表明方法重復性良好。

2.8 回收率試驗 精密稱取“2.7”項下已測知含量的厚樸藥材樣品粉末9 份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入相當于樣品中和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿、紫丁香苷含量的80%、100%、120% 的對照品溶液適量，各3 份。按“2.2”項下的方法制備供試溶液；取供試溶液200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上，進樣測定，計算和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿、紫丁香苷的回收率和RSD，結果見表1。

表1 厚樸樣品中和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿、紫丁香苷的回收率

2.9 樣品含量測定 精密稱量6 批次厚樸樣品，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，進樣5 μL，每個供試品溶液進樣3次，記錄峰面積，采用外標法計算和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿、紫丁香苷的含量。6 批樣品測定結果見表2。

3 討論

表2 厚樸樣品中和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿、紫丁香苷的含量 /%

3.1 流動相的優化 孟超等[8]以甲醇-水-磷酸(66∶34∶0.05)為流動相，采用高效液相色譜法同時測定厚樸中厚樸酚與和厚樸酚的含量，分析時間為20 min。劉明哲等[9]以甲醇-水-醋酸(80∶20∶1)為流動相，建立高效液相色譜法同時測定厚樸中厚樸酚與和厚樸酚的含量，分析時間為15 min。薛珍珍等[10]以甲醇-醋酸水( pH值3.0)為流動相，建立高效液相色譜法同時測定厚樸樣品中4種極性成分木蘭花堿、紫丁香苷、木蘭苷A 及木蘭苷B 的含量，分析時間為40 min。本研究在參考上述文獻的基礎上，分別考察了甲醇-水、甲醇-0.5%醋酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.5%醋酸水、乙腈-0.1%甲酸水共6種流動相體系，結果表明，甲醇-0.1%甲酸水作為流動相時能夠獲得較好的分離效果，分析時間僅為16 min，且藥材中其他色譜峰不干擾樣品的測定。

3.2 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器(DAD)進行全波長掃描，和厚樸酚的最大吸收波長分別為254 nm和291 nm，厚樸酚的最大吸收波長為289 nm，木蘭花堿的最大吸收波長為269 nm，紫丁香苷的最大吸收波長為264 nm。綜合考慮雜峰影響，基線平穩，色譜峰峰形，最大吸收等因素，本試驗選擇265 nm作為檢測波長。

3.3 提取方法及提取溶劑的選擇 本試驗對比了回流法和超聲法提取厚樸中4個活性成分的提取效果。結果表明，超聲提取30 min所得供試品中上述兩種活性成分的含量明顯高于回流提取法。本試驗對比了50%、70%、100%乙醇溶液和50%、70%、100%甲醇溶液對厚樸中4種活性成分的提取效率，結果顯示，100%甲醇的綜合提取效率最高，故本試驗采用100%甲醇作為提取溶劑。

3.4 本研究建立UFLC法,同時測定厚樸中和厚樸酚、厚樸酚、木蘭花堿、紫丁香苷的含量，應用該方法測定了6批厚樸中上述4個活性成分的含量。購自吉林大藥房的6批厚樸藥材均符合《中國藥典》2015年版要求(藥典規定厚樸中含和厚樸酚與厚樸酚的總量不得少于2.0%)。本研究建立的UFLC方法分析時間短、重復性及穩定性好、專屬性強，與《中國藥典》2015年版相比，又增加了厚樸中2個有效成分的質量控制方法，可為厚樸的質量標準提升提供一定的參考。