亞慢性染鋁致大鼠肝臟結構的影響

趙漢嵩，陳明生，李艷飛

(1.山東省諸城市畜牧獸醫管理局，山東 諸城 262200；2.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

鋁是自然界中含量非常豐富的一種金屬元素，因其優良的特性而被廣泛使用[1]。近年來，隨著現代工業和醫學的發展，各種鋁制物品和含鋁藥物被廣泛使用，通過食物、飲水、空氣、藥物進入人體的鋁量大大增加。大量動物試驗證實，長期鋁暴露可在動物機體肝、腎、腦、骨、肺等 器官中大量蓄積[2]。肝臟是機體最大的腺體，是外來化學物代謝和生物轉化的最主要的器官，因此也是最易遭受損害的器官。有研究表明，進入動物體內的鋁能夠很快在肝臟內蓄積并且抑制肝臟正常功能[3]，而肝細胞是肝臟的基本功能單位，進入機體的鋁是否通過損傷肝臟細胞從而影響肝臟功能，其機理尚不清楚。為了深入研究鋁暴露對肝臟的損傷作用并提供切實可靠的參考性指標，本研究通過飲水建立亞慢性鋁暴露大鼠模型，通過對肝臟顯微及超微結構的檢測，旨在揭示鋁對大鼠肝臟結構的影響，為揭示鋁毒害作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 99%(質量純度)結晶三氯化鋁，為國產分析純。Leica DM2000顯微鏡(德國徠卡公司)；GEM-1200ES型透射電子顯微鏡(日本電子公司)；德國菜卡2135型切片機(德國萊卡公司)。其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗動物和處理 48只4周齡清潔級Wistar大鼠，預飼喂一周，隨機均分為四組，分別于飲水中添加 0，64.18，128.36，256.72 mg/kg·bw AlCl3·6H2O溶液，分為對照組(C組)和低(L組)、中(M組)、高劑量(H組)染鋁組。各組大鼠自由采食飲水，試驗期為120 d。

1.3 檢測項目和方法

1.3.1 肝臟顯微檢測 試驗結束后，斷頭處死大鼠，用刀片迅速選取5 mm×5 mm×3 mm大小的肝臟組織固定于10%福爾馬林磷酸鹽緩沖液中，經固定72 h后，常規石蠟包埋，切片，切片厚6 μm，經二甲苯兩次各10 min；無水酒精兩次各10 min；90%、80%、70%酒精各5 min，蒸餾水浸5 min；蘇木素染色8 min，自來水沖洗；含1%鹽酸的70%酒精中分化20 s，蒸餾水浸5 min；70%、80%酒精各5 min；90%伊紅醇溶液中10 min；無水酒精兩次各5 min；二甲苯兩次各5 min；中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，拍照并記錄。

1.3.2 肝臟細胞超微檢測 固定：大鼠剖殺后，用刀片迅速選取快速取肝臟組織，在3%戊二醛固定液中修成大約1.5 mm×1.5 mm×2 mm小塊；置于磷酸緩沖液(PBS，pH值7.4)配置的3%戊二醛中固定1周，4 ℃下保存。浸洗與后固定：用0.1 mol/L PBS浸洗3次，每次10 min，再用1%鋨酸后固定2 h。浸洗與脫水：用0.1 mol/L PBS浸洗3次，每次10 min。酒精梯度脫水：30%、50%、70%、90%酒精，每級15 min，100%酒精兩次，每次15 min。最后換成100%丙酮15 min。浸透：將脫水組織逐級滲透，在低濃度包埋劑(100%丙酮:Epon812=2∶1)中浸透30 min，并分別在中濃度(1∶1)和高濃度(1∶2)包埋劑中浸透1 h和2 h。2 h后打開瓶蓋，浸透過夜。包埋：將寫好的標簽裝入膠囊，以牙簽將組織塊送入膠囊底中央，注入包埋劑，將包埋好的膠囊置于包埋膜具上，放恒溫箱中梯度聚合，置37 ℃、45 ℃、60 ℃下分別放置17 h、24 h、17 h。超薄切片及染色：半薄切片定位后進行超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察，拍照并記錄。

2 結果

2.1 大鼠肝臟顯微結構檢測結果 中插彩版圖1至圖4為大鼠肝臟顯微結構病理變化，C組大鼠肝臟肝小葉結構完整，肝細胞索走向正常。肝細胞呈多邊形，結構完好，排列緊密，細胞和細胞核輪廓清晰，核膜完整，細胞核大而圓，核染色質稀疏淡染，核仁清晰，細胞質豐富，多呈嗜酸性(中插彩版圖1)；L組大鼠肝細胞排列比較規整，部分肝細胞溶解，細胞界限不清，部分細胞核固縮，散在炎性細胞(中插彩版圖2)；M組肝臟細胞排列紊亂，細胞界限不清，肝細胞核溶解(中插彩版圖3)；H組肝臟細胞排列紊亂，溶解，界限不清，小葉結構消失，細胞核固縮、碎裂或溶解(中插彩版圖4)。

2.2 大鼠肝臟超微結構檢測結果 圖5至圖8為大鼠肝臟超微結構病理變化，對照組肝細胞胞漿豐富，核膜完整，核圓，核仁清晰，染色質均勻分布，細胞內可見豐富的線粒體及粗面內質網，線粒體大小均勻，結構清晰，基質豐富，呈板層分布(圖5)，內質網上富含核糖體，周圍胞漿內可見大量糖原顆粒，高爾基體清晰可見(圖6)。染鋁組大鼠肝細胞核形態異常，核皺縮，核膜內陷，細胞質內細胞器相對減少，溶酶體增多，脂滴增多，粗面內質網減少(圖7)，線粒體腫脹、變圓，排列紊亂，板層減少，線粒體嵴模糊甚至消失，粗面內質網減少并脫顆粒，溶酶體增生(圖8)。

3 討論

鋁對大鼠肝臟結構的影響 肝臟是動物體內新陳代謝的重要器官，在糖、蛋白質、脂肪、維生素和激素的代謝中發揮著重要作用，而且還具有分泌、排泄和生物轉化等功能。正常情況下，肝臟的各種代謝反應相互配合有條不紊的進行。肝臟又是一個脆弱的器官，當其受到體內外各種因素的侵害時，肝臟結構和功能將受到不同程度的損害，進而引起相應的代謝紊亂。鋁在肝臟內蓄積，可導致肝臟發生病理改變，肝細胞內線粒體出現嵴斷裂、溶解、崩潰；長期服用鋁營養液的病人，可發生膽汁郁積性肝病，肝細胞發生病理學改變[4]。研究發現，染鋁組小鼠肝臟中央靜脈周圍肝細胞表現出水腫，細胞核溶解，肝血竇擴張充血，肝細胞條索排列紊亂[5]。肝臟病理變化是評價肝損傷的客觀指標。

圖5 對照組肝臟電鏡 (×4 200)

圖6 對照組肝臟電鏡 (×11 500)a：核糖體； b：糖原顆粒： c：高爾基體

圖7 染鋁組肝臟電鏡 (×2 550)a：核皺縮； b：溶酶體； c：脂滴

圖8 染鋁組肝臟電鏡 (×11 500)a： 線粒體

本試驗發現，對照組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞索走向正常，中央靜脈周圍的肝細胞索和肝血竇呈放射狀排列。肝細胞呈多邊形，結構完好，排列緊密，細胞和細胞核輪廓清晰，核膜完整，細胞核大而圓，核染色質稀疏淡染，核仁清晰，細胞質豐富；肝臟超微結構觀察可知，肝細胞胞漿豐富，染色質均勻分布，細胞內可見豐富的線粒體及粗面內質網，線粒體大小均勻，結構清晰，基質豐富，呈板層分布，內質網上富含核糖體，周圍胞漿內可見大量糖原顆粒，高爾基體清晰可見。而染鋁組大鼠隨著染毒劑量的增加，大鼠肝臟體積明顯縮小，與周圍組織粘連，肝小葉結構消失，肝臟細胞排列紊亂，部分肝細胞溶解，細胞界限不清，肝血竇中散在大量紅細胞，散在炎性細胞，肝細胞核固縮、碎裂或溶解，超微結構觀察可知肝細胞核形態異常，核皺縮，核膜內陷，細胞質內細胞器相對減少，溶酶體增多，脂滴增多，粗面內質網減少，線粒體腫脹、變圓，排列紊亂，板層減少，線粒體嵴模糊甚至消失，粗面內質網減少并脫顆粒，溶酶體增生。

綜上所述，長期染鋁對肝細胞具有毒性作用，導致肝細胞發生組織形態學和超微結構改變，損傷肝臟結構，進而導致肝臟損傷，損害肝臟功能。