金銀花復方制劑對新城疫病毒感染雛雞免疫器官抗體生成細胞數量的影響

宋洋洋，王洪梅，李天琦，于浩然，劉 微，葛 銘

(1.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省教育廳動物普通疾病防治重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

雞新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的高度接觸性傳染病，可感染多種禽類并且在世界各地造成了嚴重的經濟損失。雖然新城疫疫苗在養禽業中廣泛應用，未出現新城疫的大范圍流行，但很多地區新城疫的免疫程序還不統一，同時新城疫病毒的毒力和免疫原性都在發生變異，導致時常發生局部流行，因此，開發抗新城疫的中草藥制劑對防治該病有一定的理論和實踐意義。我國中草藥資源豐富，有著悠久的應用歷史，中草藥不僅具有直接殺滅病毒和廣譜抗病毒的作用，還能改善動物機體內環境，提高免疫功能。本實驗應用免疫酶組織化學法，研究了金銀花復方制劑對人工感染NDV雛雞胸腺、腔上囊、脾臟抗體細胞生成數量變化的影響，為進一步研究開發更有效地防治ND的中獸藥制劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 金銀花復方制劑 金銀花、連翹、魚腥草、黃芪、白術、甘草，購自哈爾濱中藥大市場。

1.2 病毒 雞新城疫病毒(MukteswarI系)，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所惠贈，EID50為10-4.5/0.1 mL。

1.3 實驗動物 1日齡海藍白雛雞105只，雌雄各半，購自某孵化廠。

1.4 主要試劑 PBS(pH值7.2～7.4)緩沖液(現配)；正常山羊血清封閉液(武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR0009)；兔抗雞IgG(北京博奧星生物技術有限責任公司，批號：bs-0310R)；IgM(北京博奧星生物技術有限責任公司，批號：bs-0314R)；酶標羊抗兔IgG(北京博奧星生物技術有限責任公司，批號：bs-0295G)；DAB顯色試劑盒(北京博奧星生物技術有限責任公司，批號：C02-04001)；蘇木素(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，批號：TD005)。

1.5 金銀花復方制劑的制備 準確稱取金銀花、連翹、魚腥草、黃芪、白術、甘草各 150 g，先將藥物放入不銹鋼鍋內用清水浸泡1 h，加水量要淹沒過藥物3 cm，之后用大火將浸泡好的藥物煮沸，再改用中、小火維持藥物沸騰，繼續煎煮20 min，用紗布將藥汁過濾收集，再加適量清水繼續煎煮，水量淹沒過藥物即可，煎煮條件同前，沸騰后再煎煮15 min，用紗布過濾藥汁，將2次收集的藥汁混合濃縮至150 mL，將濃縮液12 000 r/min離心20 min，取上清液，用生理鹽水定容至50 mL。

1.6 實驗動物分組及處理 105只1日齡海藍白雛雞飼養至21日齡，隨機抽取15只，翅靜脈采血，用瓊脂擴散法檢測NDV母源抗體為陰性，隨機分成3組，即對照組(C組)、NDV感染組(I組)和金銀花復方制劑治療組(T組)。I組和T組雛雞經眼、鼻、口人工感染NDV，0.2 mL/只。C組雛雞經相同途徑給予相同劑量的PBS。T組雛雞于感染后6 h飲服金銀花復方制劑治療，劑量為1 mL/只，每天給藥1次，給藥方式為自由飲水，飲水前3～4 h停水，連續7 d；I組雛雞為不治療對照組，在人工感染NDV后不應用任何藥物治療。以上各組雛雞分別嚴格隔離飼養。

1.7 采樣 各組分別于感染后第1、3、5、7、14、21、28天取材。每組每次隨機抽取5只雛雞，稱重，心臟采血，快速采取免疫器官，固定于4 ℃預冷的10%中性福爾馬林緩沖液中，常規快速丙酮脫水，石蠟包埋、切片，用于IgG、IgM抗體生成細胞數量測定。

1.8 檢測指標及方法 采用免疫酶組織化學法進行檢測，一抗為1∶100稀釋度兔抗雞IgG，IgM；二抗為1∶100比例稀釋的酶標羊抗兔IgG結合物，最后經DAB避光染色。

結果檢查：參考Romppanen的格點計數法，油鏡檢查單位面積(100 mm2)免疫器官組織的特定區域：胸腺(小葉皮質、髓質)，脾臟(紅髓、白髓、淋巴小結)，腔上囊(淋巴濾泡皮質、髓質)周圍的IgG，IgM生成細胞數量。單位以103×細胞數/mm2表示。

1.9 數據處理 采用SPSS軟件進行數據處理，比較各組差異顯著性。

2 結果

2.1 NDV感染及金銀花復方制劑治療后雛雞腔上囊抗體生成細胞數量的變化 從表1可見，NDV感染21日齡雛雞后，NDV感染組腔上囊淋巴濾泡皮質IgG生成細胞數于感染后3～5 d明顯低于對照組和金銀花復方制劑治療組雛雞(P<0.05或P<0.01)，IgM生成細胞數分別于感染后5～7 d明顯低于對照組和金銀花復方制劑治療組雛雞(P<0.05或P<0.01)。NDV感染組雛雞腔上囊淋巴濾泡髓質IgG生成細胞數分別于感染NDV后5～7 d明顯低于金銀花復方制劑治療組和對照組雛雞(P<0.05)，IgM生成細胞數分別于感染后5～14 d明顯低于金銀花復方制劑治療組和對照組雛雞(P<0.05或P<0.01)。

2.2 NDV感染及金銀花復方制劑治療后雛雞脾臟抗體生成細胞數量的變化 從表2可見，NDV感染21日齡雛雞后，NDV感染組雛雞脾臟紅髓IgG生成細胞數分別于感染后3～5 d明顯低于對照組雛雞(P<0.05或P<0.01)，IgM生成細胞數分別于感染后5～7 d明顯低于對照組雛雞(P<0.05或P<0.01)。NDV感染組雛雞脾臟白髓IgG生成細胞數于感染NDV后3～7 d明顯低于金銀花復方制劑治療組和對照組雛雞(P<0.05或P<0.01)，IgM生成細胞數分別于感染后第7～14天明顯低于金銀花復方制劑治療組和對照組雛雞(P<0.05或P<0.01)。NDV感染組雛雞脾臟淋巴小結IgG生成細胞數分別于感染NDV后5～14 d明顯低于金銀花復方制劑治療組和對照組雛雞(P<0.05或P<0.01)，IgM生成細胞數分別于感染后第5～7天明顯低于金銀花復方制劑治療組和對照組雛雞(P<0.05或P<0.01)。

表1 NDV感染及金銀花復方制劑治療后雛雞腔上囊抗體生成細胞數量的變化 (×103/mm2)

注：字母不同者表示差異顯著P<0.05;大寫字母不同表示P<0.01；小寫字母不同表示P<0.05；無標記或字母相同者表示差異不顯著，P>0.05,下表同

表2 NDV感染及金銀花復方制劑治療后雛雞脾臟抗體生成細胞數量的變化 (×103/mm2)

2.3 NDV感染及金銀花復方制劑治療后雛雞胸腺抗體生成細胞數量的變化 從表3可見，NDV感染21日齡雛雞后，NDV感染組雛雞胸腺皮質IgG生成細胞數于感染后3～5 d明顯低于對照組雛雞(P<0.05或P<0.01)，IgM生成細胞數分別于感染后3～7 d明顯低于金銀花復方制劑治療組和對照組雛雞(P<0.05或P<0.01)。NDV感染組雛雞胸腺髓質IgG生成細胞數分別于感染后3～5 d明顯低于對照組雛雞(P<0.05或P<0.01)，IgM生成細胞數分別于感染后5～7 d明顯低于對照組雛雞(P<0.05或P<0.01)。

表3 NDV感染及金銀花復方制劑治療后雛雞胸腺抗體生成細胞數量的變化 (×103/mm2)

3 討論

本試驗所應用的金銀花復方制劑主要由金銀花、連翹、魚腥草、黃芪、白術、甘草等組成，該方以抑制病毒的金銀花、連翹、魚腥草為主藥，以增強免疫功能的黃芪、白術為輔藥，配以甘草調和藥性。有學者研究表明，金銀花、連翹具有顯著的抗病毒、抗炎和抗氧化作用；魚腥草具有抗病毒和增強免疫的作用；黃芪能促進動物淋巴細胞轉化率、促進未成熟的T淋巴細胞轉化并提高其活性，增強機體免疫力；白術能促進T淋巴細胞增殖、分化，改變T細胞亞群比例；甘草具有補脾益氣，和中緩急，緩解藥物毒性調和諸藥的作用[3-5]。

3.1 金銀花復方制劑對 NDV 感染雛雞免疫器官IgG生成細胞數的影響 IgG主要是由脾和淋巴結中的漿細胞合成，是產生體液免疫應答的主要抗體，具有調理吞噬、凝集、沉淀抗原、中和病毒和毒素、激活補體傳統途徑的作用[6]。本試驗測定雛雞腔上囊、胸腺、脾臟免疫器官中IgG生成細胞的數量，結果發現，雛雞感染NDV 3～5 d時IgG生成細胞的數量顯著低于對照組，提示NDV對IgG生成細胞具有嚴重的損傷作用，后期數量回升，表明雛雞免疫器官逐漸發育完善，免疫功能逐漸增強。本試驗的另一部分試驗表明，金銀花復方制劑能有效的提高外周血液中IgG的含量[7]，結果與本試驗結果對比可以發現，IgG含量的提高與金銀花復方制劑對免疫器官中IgG生成細胞的保護有關，說明金銀花復方制劑可以有效地對抗NDV對IgG生成細胞的損傷。NDV對免疫器官中IgG生成細胞的損傷可能與誘導其凋亡有關，在本試驗的另一部分試驗中觀察到腔上囊等免疫器官的萎縮現象，提示金銀花復方制劑對NDV降低IgG生成細胞數的治療機制可能是抑制NDV誘導的凋亡，并且和能夠提高T淋巴細胞和B淋巴細胞的數量有關。

3.2 金銀花復方制劑對 NDV 感染雛雞免疫器官IgM生成細胞數的影響 IgM是B淋巴細胞表面最早表達的抗體，屬于五聚體，是最高效的抗體，具有殺菌、溶菌、溶血、促進吞噬及凝集作用。本試驗中，雛雞感染NDV后，免疫器官中IgM抗體生成細胞數顯著低于對照組，表明NDV可降低免疫器官抗體生成細胞數，NDV感染雛雞體液免疫水平下降。感染后期，免疫器官抗體生成細胞數量回升，可抵抗病毒感染。雛雞感染NDV后，腔上囊有不同程度的出血、充血、萎縮等病變[8]。提示NDV對腔上囊有損害作用，導致B細胞發育和分化場所被破壞，從而降低了免疫球蛋白生物合成，抑制了雞的體液免疫功能。金銀花復方制劑治療組雛雞腔上囊、脾臟及胸腺IgM抗體生成細胞數均于感染后第5天或第7天不同程度的回升，并且于感染后3～28d不同程度的高于NDV感染組雛雞，表明金銀花復方制劑對NDV導致的免疫器官IgM抗體生成細胞數量的減少有顯著的抑制作用，可能與金銀花復方制劑能夠促進抗體合成，提高機體體液免疫功能從而在初期起到抗病毒的作用，并且與金銀花復方制劑能有效的提高B淋巴細胞的合成數量有關。

本試驗結果表明，復方金銀花制劑具有顯著的提高雛雞免疫器官抗體生成細胞數量，具有增強免疫功能的作用。