貂源綠膿桿菌山東分離株exoA-fliC基因的原核表達及其免疫原性研究

秦曉冰，馬鳳芹，單 虎

(青島農業大學 山東省預防獸醫學重點實驗室，山東 青島 266109)

綠膿桿菌又稱銅綠假單胞菌(PA)，屬于假單胞科假單胞屬。PA可以引起水貂出血性肺炎，該病以肺部腫脹、出血為主要特征，是一種嚴重威脅養貂業的急性傳染病[1-2]。PA為條件性致病菌，存在于污染的水、飼料、環境及患病動物排泄物等，能經口、鼻途徑感染水貂[3]。水貂發生PA感染，往往會使用抗生素治療，但因PA的多重耐藥常致使藥物治療失敗。因此，尋找新的PA防治方法勢在必行。

目前，PA的鞭毛、纖毛、外膜蛋白、毒素等不同抗原和毒力因子有望開發成亞單位疫苗來防治該傳染病[4-5]。PA的外毒素A(exoA)可通過滅活延伸因子2來阻礙蛋白質的合成，具有抑制宿主對感染產生反應的能力；還可誘導動物模型產生免疫應答，生成保護性抗體，exoA被譽為預防PA感染極有前途的一種疫苗源[6]。PA的鞭毛可以與Toll5受體相互作用，誘導炎癥反應，而且不同血清型PA間具有相同的鞭毛蛋白，能起到交叉保護作用。fliC 基因是鞭毛蛋白的主要基因，由于有良好免疫原性，常被選為疫苗源進行研究[7-8]。

單一抗原不能產生持久的保護性免疫，含有不同抗原的疫苗卻能發生高水平免疫應答[9]。本試驗利用山東省水貂PA分離株，對其exoA和fliC蛋白進行了融合表達并對其免疫原性作了研究，旨在開發出安全高效的基因工程疫苗，為有效預防與控制水貂PA的感染開辟一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料 水貂PA致病性分離株(PASD01菌株)、綠膿桿菌標準菌株ATCC27853，均由山東省預防獸醫學重點實驗室提供。昆明系小鼠，購自青島派特福德養殖專業合作社。

ExTaqDNA聚合酶及其他工具酶、DL-5 000 DNA Marker、pMD-19T，購自大連TaKaRa公司；X-gal、IPTG，購自北京索萊寶科技有限公司；UNIQ-10 柱式DNA回收試劑盒，購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 引物 根據GenBank登錄的PAO1exoA基因和8821MfliC基因，設計兩對引物(見表1)，引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成，預期產物長度exoA基因為1 212 bp，fliC基因為510 bp。

表1 用到的引物

注：下劃線部分為酶切位點

1.3 目的基因的擴增 菌株PASD01細菌液為模板，用exoA-F和exoA-R進行exoA(I區+II區)擴增；以fliC-F和fliC-R進行fliC 擴增。PCR體系(25 μL)：10×PfuBuffer with MgSO42.5 μL，dNTP Mix 2 μL，引物(20 μmol/L)各0.5 μL，PfuDNA polymerase(2.5 U/μL)0.25 μL，基因組DNA 1 μL，DMSO 1 μL，40%甘油3 μL，ddH2O 14.25 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，68.2 ℃(exoA)或57.9 ℃ (fliC)1 min，72 ℃ 3 min(exoA)或2 min(fliC)為一個循環，共30個循環，72 ℃延伸20 min。擴增exoA-fliC基因，25 μL體系用引物(20 μmol/L)exoA-F、fliC-R各0.5 μL，分別用exoA 擴增產物4 μL、fliC 擴增產物1 μL作用模板，并加入DMSO μL 和40%甘油4 μL。反應程序同上，用1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定后回收。

1.4 原核表達載體的構建與誘導表達 將exoA-fliC基因與pMD19-T載體連接，轉入E.coliDH5α感受態細胞，篩選陽性克隆載體pMD19-T-exoA-fliC。將其與表達載體pET30a分別經BamH I、XhoI雙酶切，膠回收后16 ℃連接過夜，轉到DH5α 感受態細胞后，PCR、酶切鑒定后送華大基因科技服務有限公司測序。測序后，表達載體經IPTG誘導表達，培養相應的重組菌，離心、洗滌、懸浮，超聲破碎，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE。用 HisTrapTMHP固定化金屬配體親和層析柱純化超聲破碎沉淀，純化、尿素復性，透析后，再SDS-PAGE電泳分析，BCA試劑盒測定其濃度。

1.5 表達蛋白的Western Blot分析 復性后的表達蛋白分別以兔抗水貂PA陽性血清和兔抗水貂PA鞭毛蛋白血清作為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，ECL Plus發光液加到PVDF膜上，X線片夾中曝光。

1.6exoA-fliC嵌合蛋白免疫小鼠及間接ELISA檢測 向exoA-fliC嵌合蛋白復性液加等體積弗氏不完全佐劑，混合乳化，50 μg/只皮下多點免疫昆明系小鼠，于第3周和第6周各加強免疫1次，共免3次，同時設立PBS對照組。第三次免疫后7 d，挖眼眶采血。以兔抗水貂PA鞭毛蛋白陽性血清和陰性血清為一抗，采用棋盤法確定exoA-fliC嵌合蛋白的最佳包被濃度。利用間接ELISA方法測定抗體效價，復性的exoA-fliC嵌合蛋白包被酶標板，加10 000倍稀釋血清，倍比稀釋，酶標儀測定OD450值。

2 結果

2.1 目的基因的擴增exoA和fliC基因擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段分別1 212 bp和510 bp，與預期相符(圖1)。重疊PCR得到的exoA-fliC基因，片段為1 722 bp，與預計相符(圖2)。

圖1 exoA、fliC基因擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

圖2 重疊PCR產物瓊脂糖凝膠電泳

M：DL-5 000 DNA分子量標準； 1～2：exoA-fliC

2.2 表達質粒的鑒定 重組質粒pET30a-exoA-fliC經PCR擴增得到1 722 bp的條帶，BamHI、XhoI雙酶切獲得5 422 bp和1 722 bp左右的片段，均與預期相符(圖3)，重組表達載體構建正確。

圖3 重組表達質粒pET30a-exoA-fliC鑒定

M：DL-5 000 DNA分子量標準； 1：重組表達質粒雙酶切產物； 2：重組表達質粒

2.3 IPTG誘導時間與誘導濃度的確定 將誘導表達菌裂解后進行SDS-PAGE分析，經考馬斯亮藍染色，在蛋白質相對分子質量約68 kDa的位置上有表達明顯的目的條帶，誘導開始后，exoA-fliC嵌合蛋白的表達逐漸增多(圖4)，經BandScan5.0分析IPTG誘導7 h達到高峰。不同濃度IPTG均可誘導exoA-fliC蛋白的表達，經分析IPTG終濃度為0.8 mmol/L時exoA-fliC蛋白的表達量最高。

圖4 不同誘導時間對蛋白表達的影響

M：蛋白質分子量標準； 1：IPTG誘導8 h的空載體pET-30a；2～9：經IPTG誘導1，2，3，4，5，6，7 h和8 h的轉化菌菌體裂解物

2.4 嵌合蛋白exoA-fliC表達形式分析、純化及Western Blot分析 將誘導的菌體經破碎離心后，將上清和沉淀分別進行SDS-PAGE，exoA-fliC蛋白主要位于沉淀中，表明該蛋白主要以包涵體的形式存在。沉淀經親和層析純化，分析后確定蛋白純度約為85%。分別用兔抗水貂綠膿桿菌鞭毛蛋白血清及兔抗水貂綠膿桿菌陽性血清作為一抗對重組蛋白進行Western Blot檢測，在約68 kDa處均出現特異性條帶(圖5)，表明原核表達產物正確，具有良好的反應原性。

圖5 exoA-fliC的表達形式、純化及Western Blot分析

M：蛋白分子量標準； 1～2：重組菌破碎后上清與沉淀；3：重組菌表達總蛋白； 4～5：蛋白純化產物；6～7：不同一抗的重組蛋白Western Blot

2.5 ELISA檢測多克隆抗體效價 選擇5 μg/mL的exoA-fliC嵌合蛋白為包被濃度，陽性血清的OD450值(P值)最接近1.0，陰性血清OD450值(N值)較低，P/N值較高。通過ELISA檢測多克隆抗體的效價可達1∶640 000(圖6)。

3 討論

圖6 ELISA法測定exoA-fliC多克隆抗體效價

本試驗用exoA-fliC重組蛋白作為預防水貂PA感染的候選疫苗，既克服了天然外毒素和鞭毛蛋白直接提純的困難，又保證二者構象不發生改變，保持其天然的免疫學特性。采用基因工程方法，不僅使蛋白大量表達成為可能，而且刪除這兩個基因的不必要區域而瞄準保守區和免疫原性區。本研究擴增1 212 bp外毒素A Ⅰ區+Ⅱ區(編碼外毒素A404 N末端氨基酸)，刪除其具有細胞毒性的Ⅲ區。這樣既保留其大部分抗原性，能誘導針對PA中毒的免疫保護作用，又因刪除毒力基因而使其具有安全性；對于鞭毛蛋白基因，僅擴增編碼鞭毛蛋白N末端170氨基酸保守序列的510 bp基因片段，用于融合表達及蛋白生產。

本試驗利用重疊延伸PCR方法制備exoA-fliC融合基因，巧妙地將來源不同的擴增片段拼接起來，無需限制性內切酶的消化和連接處理，也無任何目的基因以外的其他序列摻入，展示出重疊PCR簡便、高效、快速、易于操作等優點。為基因工程亞單位疫苗防治水貂PA開辟了新思路。