豬偽狂犬病病毒HB-11株的分離鑒定及gC基因的分析

馬晶晶，吳碧清，高俊鋒，鄭良益，舒銀輝，賴 志

(1. 上海創宏生物科技有限公司，上海 松江 201619；2. 武漢中博生物股份有限公司，湖北 武漢 430070)

豬偽狂犬病(Porcine pseudorabies，PR)是甲型皰疹病毒亞科豬皰疹病毒I型引起的一種急性傳染病[1-2]。此病可引起妊娠母豬繁殖障礙、流產、死胎、呼吸癥狀；新生仔豬除出現神經癥狀外,還可侵害消化系統，臨床癥狀主要表現為腹瀉、嘔吐、生長不良等。豬既是本病原的原發感染宿主，又是病毒的長期貯存者和排毒者，在豬偽狂犬病的傳播上起著重要作用。

豬偽狂犬病病毒(PRV)屬于皰疹病毒科，α-皰疹病毒亞科，基因組為雙鏈DNA，全長150 kb，其中gC含量在基因組中最高達73%，至少含有70個基因，可編碼100多種蛋白質[3-4]。gC是PRV的一種重要糖蛋白，雖然gC不是PRV復制所必需的，但作為PRV最主要的保護性抗原之一，它不僅能在病毒對靶細胞的吸附、釋放和病毒毒力方面產生作用，還能誘導細胞免疫，產生中和抗體，還能激活補體系統，產生防御作用[5-7]。

自2011年以來，我國華北、華東、華中、華南等地區出現豬偽狂犬病流行，造成母豬流產、產死胎、木乃伊胎，仔豬、保育豬群出現大量死亡。最近研究表明，與以往的流行株相比，新流行株的抗原性已發生了變異，gC基因存在抗原飄移現象，從而導致現有疫苗不能提供完全保護[8-9]。我們于2015年9月，在河北某豬場大批死亡育肥豬群的腦及肺臟中分離到1株病毒，并進行了全面鑒定，并對其進行了gC基因的擴增和序列分析，以期獲得流行毒株PRV分子變異趨勢，為進一步鑒別PRV疫苗株和野毒株提供理論依據，為豐富PRV的分子流行病學和疫苗的研制提供參考依據。

1 材料

1.1 細胞 BHK-21細胞、IBRS-2細胞、HeLa細胞、Vero細胞,均購自中國典型培養物保藏中心(武漢大學)。原代雞胚成纖維細胞由武漢中博生物股份有限公司按常規方法進行制作。

1.2 病毒 豬偽狂犬病病毒閩A株、Bartha K61株，購自中國獸醫藥品監察所。

1.3 血清 豬偽狂犬病病毒標準陰性、陽性血清由武漢中博生物股份有限公司制備。新生犢牛血清，購自杭州新銳生物工程有限公司，使用前56 ℃滅活30 min。

1.4 DMEM培養基 購自北京清大天一生物技術有限公司，貨號：MD202。

1.5 實驗動物

1.5.1 BALB/c小鼠 清潔級，體重20～22 g，購自武漢生物制品研究所。

1.5.2 家兔 普通級，體重1.8～2.0 kg，購自武漢市萬千佳禾實驗動物養殖有限公司。

1.5.3 斷奶仔豬 6～7周齡，來自健康豬群，PRV中和抗體效價不高于1∶2，PCR抗原檢測為陰性，購自武漢市江夏區魯湖豬場。

2 方法

2.1 病料處理 對豬場發病死亡的仔豬采集腦和肺組織，混合后在滅菌的研缽內剪碎，用DMEM作1∶5倍稀釋成懸液，-70 ℃反復凍融3次。經3 000 r/min 離心30 min，取上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，加入適量青、鏈霉素，-70 ℃保存作為接種材料。

2.2 病毒分離 將上述處理的樣品接種于已長成單層的BHK-21細胞的培養瓶中(100 mL)，每瓶接種2 mL，接種3瓶，設正常細胞對照1瓶。置于37 ℃恒溫箱吸附1 h，然后加入DMEM維持液8 mL。培養并觀察3日，盲傳3代，有細胞病變效應(CPE)的繼續傳代，直至穩定。并用具有PRV典型CPE特征的培養物分別接種IBRS-2細胞、HeLa細胞、Vero細胞和原代雞胚成纖維細胞。同時用PRV閩A株接種上述各細胞，比較兩者所致CPE情況。

2.3 分離病毒的克隆純化和培養 用維持液將病毒液作10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-86個稀釋度接種已長成BHK-21細胞單層的平皿，每個稀釋度接種4個平皿，每個平皿接種0.1 mL。經37 ℃培養箱孵育1 h后，加入44 ℃營養瓊脂，每個平皿10 mL，待凝固后翻轉平皿，置于5%二氧化碳培養箱內培養。48 h后加入0.01%中性紅5 mL覆蓋，培養72 h后選取產生空斑的平皿，選擇小而孤立的空斑挑出，加入含0.5 mL營養液的離心管中，經凍融后以3 000 r/min 離心10 min，取上清進行擴大培養。

2.4 病毒含量的測定 純化后，取在BHK-21細胞適應的病毒液，采用微量法測定其在BHK-21細胞上的感染力。同樣方法測定PRV閩A株在BHK-21細胞上的TCID50。

2.5 病毒的鑒定

2.5.1 電鏡形態的觀察 取病毒懸液反復凍融3次，以3 000 r/min離心30 min，取上清液以 40 000 r/min 離心3 h，沉淀物用2%磷鎢酸鈉負染，觀察病毒粒子形態。

2.5.2 中和試驗 將分離株用滅菌生理鹽水稀釋成為每0.1 mL含有200 TCID50的病毒懸液，與等量的抗豬偽狂犬病病毒特異性血清充分混合，37 ℃作用1 h后，接種形成良好單層BHK-21細胞培養板，接種6孔，置37 ℃培養。同時設立不中和病毒懸液為陽性對照組，置同條件下培養。5日后觀察各細胞孔是否出現CPE。

2.6 病毒的血清學特異性

2.6.1 制備PRV HB-11抗血清 將HB-11病毒純化、培養后，通過甲醛滅活制備抗原，將制備好的抗原與弗氏完全佐劑按1∶1混合肌肉注射SPF雞，第7天將抗原與不完全弗氏佐劑按照1∶1混合進行第2次免疫，第14天將抗原第3次免疫SPF雞。第3次免疫7日后，采血，制備HB-11的陽性血清。把制備的血清置56 ℃水浴滅活30 min，分裝后置-20 ℃凍存。

2.6.2 抗血清中和試驗 采用固定血清稀釋病毒法，將分離得到的14株分離病毒株和疫苗毒株閩A株、Bartha K61株作10倍系列稀釋，使其稀釋度為10-1～10-8，然后各個稀釋度的病毒液與等量偽狂犬分離株HB-11的陽性血清混合，置于37 ℃作用1 h，再接種96孔細胞板，每個稀釋度6孔，每孔100 μL，同時設未加抗血清的對照。48～96 h后觀察CPE，判定結果，計算PRV HB-11抗血清對各PRV毒株的血清中和指數。

2.7 動物毒力試驗

2.7.1 對家兔的毒力試驗 將分離培養的病毒懸液F5代接種健康家兔2只，每只在臀部皮下注射2 mL，并設注射DMEM培養液的健康家兔2只作為對照。連續觀察5日。記錄臨床反應觀察結果。

2.7.2 對小鼠的毒力試驗 將分離培養的病毒懸液F5代接種BALB/c小鼠4只，每只在腹部皮下注射0.1 mL，并設注射DMEM培養液的BALB/c小鼠4只作為健康對照。連續觀察5日。記錄臨床反應觀察結果。

2.7.3 對斷奶仔豬的毒力試驗 試驗前篩選6～7周齡仔豬15頭(PRV中和抗體效價不高于1∶2，PCR抗原檢測為陰性)，隨機分為3組，每組5頭。A組接種病毒原液(108.33TCID50/mL)，B組接種病毒含量為106.0TCID50/mL，C組為空白對照，接種方式為每頭肌肉注射3 mL同時滴鼻3 mL。每日測量體溫，觀察仔豬臨床癥狀，并計算3 d平均值，繪制評分表。剖檢病死豬，觀察肺和腦部病理變化；攻毒后觀察21日，剖檢所有未死亡仔豬，觀察肺部病變，記錄肺部評分(臨床評分法按照參考文獻[12]方法進行。肺部評分按照參考文獻[13]方法進行)。

2.8 gC基因測序

2.8.1 引物合成 根據GenBank中登錄的PRV全基因序列設計gC基因段引物：gC-F：5′-ATGGCCTCGCTCGCGTGCGCTC-3′,gC-R:5′-TCACGGCCCCGCCCGGCGGTAGTAG-3′，擴增片段大小為 1 440 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.8.2 病毒DNA提取及PCR鑒定 使用北京天根生化科技有限公司DP315試劑盒說明書提取PRV DNA，利用上述引物擴增PRV gC基因全序列。PCR反應總體積25 μL：DNA模板2 μL，2×gC Rich Buffer 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O補至25 μL。PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；53 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.8.3 gC基因的克隆與序列分析 將目的基因膠回收克隆至pMD18-T載體中，送上海杰李生物技術有限公司進行序列測定，每個樣品選擇3個克隆，每個克隆測序3次。利用生物信息軟件對此分離株及近年本實驗室分離到的變異株和疫苗株Bartha株gC基因序列進行比對分析。

3 結果

3.1 病毒分離結果 將經過除菌處理的腦和肺臟組織懸液樣品，接種BHK-21細胞，傳至第5代，穩定在24～36 h可見細胞腫脹、出現顆粒、失去光澤，繼而圓縮、脫落，并可見到許多巨細胞，與PRV閩A株所致細胞病變類似。將第5代細胞培養物接種豬腎傳代細胞IBRS-2、HeLa細胞、Vero細胞以及原代雞胚成纖維細胞，均產生典型細胞病變(見圖1)，表明分離株能在不同細胞上增殖。

圖1 細胞病變圖

注：從左往右依次為未接毒，接毒24 h，接毒36 h的細胞圖

3.2 病毒克隆純化 分離病毒在平皿上經過3日培養后，在產生空斑細胞單層(10-4稀釋度)上可見單個的可數空斑，空斑直徑在1 mm～4 mm之間，大小不一，挑出直徑1 mm的空斑。重復克隆2次后接種BHK-21細胞，傳代3次后，75%CPE出現時間穩定在24～36 h，表明獲得一株純病毒。

3.3 病毒含量測定 按Reed-Muench法計算，所分離病毒和PRV閩A株在BHK-21細胞上的病毒含量分別為108.33TCID50/mL和107.75TCID50/mL。

3.4 病毒的鑒定

3.4.1 電鏡觀察結果 病毒上清液經超高速離心，取沉淀物經磷鎢酸鈉負染后在電鏡下見到典型的PRV顆粒。病毒粒子形狀呈圓形，病毒顆粒大小為150 nm左右(見圖2)。

圖2 病毒電鏡圖片 (40 000×)

注：箭頭所指處為PRV顆粒

3.4.2 中和試驗結果 以200 TCID50的病毒液與倍比稀釋的PRV標準陽性血清反應，按Reed-Muench法測得標準陽性血清的中和效價為1∶32。試驗結果表明，該分離病毒為PRV。

3.5 PRV HB-11血清學特性試驗結果 將6株偽狂犬病病毒分離株、閩A株、Bartha K61株按10倍比稀釋后，與等量PRV HB-11的陽性血清混合后，接種細胞，37 ℃培養96 h后觀察到CEF上無CPE，試驗結果證明，15株偽狂犬病病毒分離株、閩A株以及Bartha K61株病毒能被PRV HB-11陽性血清中和，中和指數為832～6 761，結果見表1。

表1 PRV HB-11陽性血清對各毒株的中和指數

3.6 動物毒力試驗結果

3.6.1 對小鼠和家兔的接種試驗結果 以所分離的病毒懸液接種家兔和小鼠均產生了典型的偽狂犬病癥狀。接種36 h后家兔表現為奇癢，用嘴啃咬注射部位，使注射部位被毛脫落，皮膚受損，暴露出紅色肌肉，頭、頸、背部等多處擦傷，48 h后四肢出現麻痹而死亡，注射DMEM維持液的對照家兔均健活；小鼠于接種后24 h表現為狂躁不安，于接種后48 h自行啃咬注射部位，4只小鼠于攻毒60 h死亡，注射DMEM培養基的對照小鼠均健活。結果表明，分離病毒液對小鼠和家兔的毒力較強。

3.6.2 對斷奶仔豬的接種試驗 接種病毒原液組A組(108.33TCID50/mL)，斷奶仔豬全部死亡(5/5)。接種106.0TCID50/mL B組，仔豬均體溫升高，并出現不同程度的食欲下降、精神不振、呼吸困難等臨床癥狀，其中2頭仔豬(H2、H5)出現了神經癥狀。H3在攻毒后第9天死亡，H5在攻毒后第11天死亡，共死亡2頭仔豬(2/5)。剖檢攻毒試驗仔豬，肺部均表現出血、水腫、壞死，仔豬腦有出血、充血病變；空白對照組C組無任何臨床癥狀，體溫在38.5 ℃～39.5 ℃，剖檢后觀察，肺和腦部無任何病理變化，結果見臨床癥狀評分(圖3)。結果表明，新分離的HB-11株為豬偽狂犬病病毒強毒株。

圖3 攻毒后仔豬臨床評分及肺部評分

注：臨床評分法按照參考文獻[12]方法進行;肺部評分按照參考文獻[13]方法進行

3.7 gC基因PCR擴增結果 將此分離株和近年本實驗室分離到的PRV-JX，PRV-X兩株新流行毒株及疫苗株Bartha進行PCR擴增后，凝膠電泳結果顯示，4株PRV毒株在1 440 bp均有擴增條帶，見圖4。

圖4 PRV gC基因PCR擴增圖

M：DNA分子質量標準； 1～5依次為陰性對照，PRV HB-11株，PRV-JX株，PRV-X株，Bartha株

3.8 gC基因序列分析 將該分離株測序結果與本實驗室及近年本實驗室分離到的變異株PRV-JX株，PRV-X株和疫苗株Bartha株gC基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列進行比對分析。結果表明，PRV HB-11株與PRV-JX株，PRV-X株和疫苗株Bartha株gC基因序列的同源性分別為99.3%，99.4%和94.8%(見圖5)，說明該分離株與近年本實驗室分離到的新流行毒株同源性較高，與Bartha疫苗株的同源性相對較低。氨基酸序列比對結果顯示，分離株與PRV-JX株，PRV-X株相對于疫苗Bartha株的gC蛋白中有相同的7個氨基酸的插入(158AAASTPA164)(見圖6)。

圖5 分離株與PRV-JX株，PRV-X株和疫苗株Bartha株gC基因核苷酸序列的比對結果

圖6 分離株與PRV-JX株，PRV-X株和疫苗株Bartha株gC基因氨基酸序列的比對結果

4 討論

從河北某豬場的病死仔豬中分離到的一株病毒，在BHK-21細胞上產生CPE，并且能與PRV標準陽性血清發生中和反應。病毒在電鏡下可觀察到150 nm左右的典型的偽狂犬病病毒粒子，用所分離的病毒接種家兔、小鼠和仔豬均出現典型的偽狂犬病癥狀，這一結果證實所分離的毒株是豬偽狂犬病病毒毒株。

本試驗中，測得的豬偽狂犬病病毒HB-11株在BHK-21細胞上的TCID50為108.33TCID50/mL，該病毒接種家兔2只、小鼠4只不僅均出現典型的偽狂犬病癥狀，而且均全部死亡，106.0TCID50/mL接種5頭仔豬，每頭豬頸部肌肉注射3.0 mL，同時滴鼻3.0 mL可導致仔豬5/5出現臨床癥狀并出現2/5死亡，剖檢發病豬的肺部病理變化，均表現出血、水腫、壞死等病變。說明分離的豬偽狂犬病病毒是一株毒力較強的野毒株，命名為HB-11株。

PRV-gC基因序列比對分析結果顯示，豬偽狂犬病病毒HB-11株與近年本實驗室分離到的PRV變異株JX株和X株同源性較高，與Bartha疫苗株親緣關系較遠，僅為94.8%；氨基酸序列比對結果顯示，其gC基因序列相對于Bartha疫苗株序列有7個連續氨基酸的插入(158AAASTPA164)，表明近年來PRV的分離株正向遠離疫苗株的方向變異，這也進一步證明了2012年以來豬偽狂犬病的暴發可能由于現有的豬偽狂犬疫苗株Bartha株已不能對新流行的偽狂犬變異株提供完全保護。流行毒株PRV-gC基因的研究分析對于研究PRV多樣性及分子進化具有重要意義，有助于實驗室在分子水平上確定豬偽狂犬病的存在和發生原因，為豬場的免疫方案提供更準確的技術依據。gC基因序列之間的差異是否會影響豬偽狂犬病病毒HB-11的毒力和抗原性的變化，還需進行全基因測序分析PRV的其他基因組內編碼的蛋白之間的相互作用，以期為新疫苗的研發及豬偽狂犬病的防控提供理論依據。