廣東地區(qū)小鵝瘟病毒分離鑒定及全基因序列的測定分析

劉佳佳，蘇曉娜，王占新，覃健萍，曾凡桂，田 野，魯俊鵬

(1.廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 新興 527439；2.廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 新興 527439)

鵝細(xì)小病毒病又稱小鵝瘟，是由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起的雛鵝和雛番鴨的一種高度接觸性傳染病，造成腸栓塞、纖維素性腸炎及神經(jīng)癥狀等，具有高發(fā)病率和死亡率,嚴(yán)重制約著水禽業(yè)的發(fā)展。

GPV基因組為單鏈線性DNA，5 106 bp。其基因組由左右兩個(gè)開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)和兩端的末端重復(fù)序列(Inverted terminal repeats, ITR)組成[1]。分析GenBank上各水禽細(xì)小病毒基因組序列發(fā)現(xiàn)，在兩個(gè)ORF之間間隔18 bp，左側(cè)ORF編碼NS1和NS2兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。右側(cè)編碼區(qū)編碼結(jié)構(gòu)蛋白，GPV共編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2和VP3)，VP2和VP3是病毒的主要衣殼蛋白，GPV主要抗原決定簇分布在其中[2]。

本實(shí)驗(yàn)室近幾年一直在對(duì)細(xì)小病毒進(jìn)行流行監(jiān)控，2016年廣東地區(qū)一鵝場7日齡的雛鵝發(fā)病死亡率高達(dá)70%，剖檢發(fā)現(xiàn)雛鵝的腸道有栓塞現(xiàn)象，胰腺有白點(diǎn)，肝臟腫大等疑似小鵝瘟的癥狀。實(shí)驗(yàn)室采集發(fā)病雛鵝的腸、肝臟、胰腺等進(jìn)行了病毒的分離鑒定，確診為小鵝瘟，并對(duì)其進(jìn)行了全基因序列的測定分析，了解了廣東地區(qū)流行GPV的基因特征，又為疫苗的選用及疾病的防治提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 廣東地區(qū)某鵝場。

1.2 鴨胚 購自廣東地區(qū)某孵化場。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 購自佛山某鴨場(母源抗體較低)。

1.4 質(zhì)粒、菌株 克隆載體pMD18-T、Top10感受態(tài)細(xì)胞，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.5 試劑及耗材 胰蛋白胨、酵母提取物，購自 OXOID 公司；0.22 μm無菌濾器，購自Millipore 公司；瓊脂糖，購自北京百奧康生物技術(shù)有限公司；Gold view I型核酸染色劑、DNA Marker DL-2 000、 DL-5 000，PremixTaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 plus dye)、LATaq聚合酶、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)試劑盒,均購自TaKaRa公司；AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit、 AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit，購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，購自GIBCO公司。

1.6 方法

1.6.1 病料的處理及病毒在鵝胚上復(fù)制 將采取疑似發(fā)病的鵝的肝臟、小腸等組織器官研磨，加入適量的雙抗溶液，反復(fù)凍融3次，6 000 r/min離心10 min，4 ℃靜置4 h，然后通過尿囊腔接種法接種12日齡鴨胚，每胚0.2 mL，置于37 ℃孵化箱孵化，每天照鴨胚，棄去48 h內(nèi)死亡的鴨胚。收集48 h后死亡的鴨胚尿囊液，同時(shí)觀察胚體變化，并用此尿囊液在12日齡番鴨胚上盲傳3代。收集尿囊液，于-80 ℃保存。

1.6.2 病毒在GEF細(xì)胞上的復(fù)制 首先按照2010年版獸藥典制備雞胚成纖維細(xì)胞SOP標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行GEF細(xì)胞的制備，使每毫升約含1×106個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞鋪到6孔板中，沒孔2 mL，24 h生長至單層后，接種上述尿囊液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h 后，用PBS洗3遍，加入含2%FBS DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，每天觀察細(xì)胞病變，在出現(xiàn)80%細(xì)胞病變或96 h后，收集細(xì)胞及上清，于-80 ℃保存。

1.6.3 小鵝瘟特異性PCR檢測 小鵝瘟特異性檢測引物參照夢(mèng)繁星發(fā)表文章，引物序列為F:5′-CCAAGCTACAACAACCACATCTAC-3′，R：5′-CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC-3′[3]，將收取的尿囊液和細(xì)胞液按照 AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，參照 PremixTaqTM(LATaqTMVersion 2.0 plus dye)試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。體系為PrimerTaq：10 μL，上游引物：1 μL，下游引物：0.1 μL，ddH20:6μL, 模板：2 μL。PCR 擴(kuò)增儀中按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增： 94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 40 s/40 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.6.4 病毒動(dòng)物回歸 將上述收集到的致死鵝胚的尿囊液，取0.2 mL 104.0EID50/0.2 mL的病毒量肌肉注射7日齡無母源抗體的番鴨。攻毒后逐日觀察并記錄小鴨的精神狀態(tài)、飲食、飲水情況，發(fā)病和病死情況。

1.6.5 細(xì)小病毒總DNA的提取 按照 AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6.6 全基因引物的設(shè)計(jì)與合成 引物設(shè)計(jì)參照在GenBank上載的GPV B 株、GPV 06-0329株和MDPV GX5株序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如表1 所示。

表1 全基因序列測序引物序列

1.6.7 PCR擴(kuò)增 參照 PremixTaqTM(LATaqTMVersion 2.0 plus dye)試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。體系為PrimerTaq：20 μL，上游引物：2 μL，下游引物：2 μL，ddH20:12 μL, 模板：4 μL。PCR 擴(kuò)增儀中按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增： 94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 40 s/2 min，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增ITR區(qū)和中間編碼區(qū)過程中，72 ℃延伸的時(shí)間分別定為40 s和 2 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切下目的條帶。

1.6.8 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收和純化 使用 Axygen 凝膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收與純化，按說明書操作進(jìn)行。

1.6.9 PCR純化產(chǎn)物與載體連接 連接反應(yīng)參照TaKaRa公司pMD18-T Vector使用說明書進(jìn)行。連接反應(yīng)體系為pMD18-T Vector：1 μL，Solution I：5 μL，PCR產(chǎn)物：4 μL，混勻離心后，于16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物直接用于下一步轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.6.10 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 將感受態(tài)細(xì)胞從-80 ℃中取出，融化后取50 μL，加入上述的連接產(chǎn)物5 μL，輕輕混勻，冰上放置30 min；于42 ℃熱休克90 s后迅速冰浴10 min；加入200 μL LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃搖床中以160 r/min振搖培養(yǎng)60 min；將慢搖后菌液均勻涂布于已預(yù)熱的LA固體培養(yǎng)基中，待菌液被平板吸收后，將平板放在37 ℃溫箱中倒置培養(yǎng)12～16 h。

1.6.11 陽性菌落的篩選和鑒定 從上述平板中挑取5～10個(gè)單克隆菌落，分開接種于1 mL含LA液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min振搖培養(yǎng)4 h。直接用上述菌液作為PCR模板進(jìn)行菌液PCR鑒定，鑒定陽性的，每個(gè)基因片段選擇3個(gè)經(jīng)PCR檢測為陽性的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.6.12 序列拼接與分析 測序結(jié)果用DNAStar分析軟件中的SeqMan進(jìn)行拼接、整理，利用MegAlign進(jìn)行序列的比對(duì)分析，利用MEGA 7.0進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離

2.1.1 病毒在鵝胚上的分離 鵝胚第一代在第6天左右出現(xiàn)死亡，取出胚體，可見胚體頸部四肢皮膚均有充血、出血，肝臟輕度出血。見中插彩版圖1。

2.1.2 病毒在GEF上的分離 尿囊液接種DEF細(xì)胞，盲傳3代，在第4天左右細(xì)胞出現(xiàn)變圓、皺縮，折光度增強(qiáng)，最后細(xì)胞脫落細(xì)胞間隙增大等細(xì)胞病變。見中插彩版圖2。

2.1.3 PCR鑒定 PCR 擴(kuò)增病毒基因，得到的條帶與預(yù)期條帶大小相似375 bp。

2.1.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果 第2天開始發(fā)病，第3天出現(xiàn)死亡；前期發(fā)病嚴(yán)重，第2周后癥狀開始減輕，到第3周病鴨基本恢復(fù)正常；病鴨出現(xiàn)斷毛、精神沉郁、腳軟喜臥；病死鴨剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟腫大、出血，胰腺發(fā)白出血，十二指腸糜爛，卵黃蒂附近腸段嚴(yán)重腸栓塞、腸出血。見中插彩版圖3。

2.2 全基因序列的測定分析 應(yīng)用序列分析軟件DNAStar Lasergene 7.1中的SeqMan對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行拼接，各毒株基因組片段具體信息如下表2所示。

表2 毒株基因片段信息表

2.2.1 全基因序列同源性分析 分離株ZJF序列全長為5 046 bp，與江淮地區(qū)報(bào)道的鵝源LH株的基因全長相同，同源性也最高為98.6%;與廣東早前分離株GDaGPV同源性為93.8%;與番鴨小鵝瘟SDHZ1604、JS1603株同源性為94.9%、95%;與番鴨細(xì)小病毒代表株MDPV-P1株及SAAS-SHNH株同源性最低為81.4%，86.1%。分離株ZJF ITR區(qū)全長與江淮地區(qū)LH株、SHFX1201株相同，為414 bp，相較于歐洲標(biāo)準(zhǔn)株Virulent B株、GDaGPV株在67-80(CACGTGTTTCCGGT)及333-347(AGCATGTGACCGGA)處有堿基缺失。ZJF株的結(jié)構(gòu)基因VP1全長為2 199 bp，無任何核昔酸的缺失或插入，編碼732個(gè)氨基酸。與江淮地區(qū)Yan-1株核苷酸、氨基酸同源性最高為99.7%(99.3%)。與江淮地區(qū)LH、SHFX1201株等分離株核苷酸、氨基酸同源性在97.3%～97.9%(98.2～99.3%)之間。與歐洲標(biāo)準(zhǔn)株Virulent B株核苷酸、氨基酸同源性為97.5%(98%)。與廣東早前分離株GDaGPV株核苷酸、氨基酸同源性較低，分別為94.5%、94.7%(97.4%、97.8%)。與番鴨小鵝瘟SDHZ1604、JS1603株核苷酸、氨基酸同源性分別為95.2%、95.3%(97.3%、97.4%)。

2.2.2 VP1基因進(jìn)化樹分析 分離株ZJF屬于GPV分支，在這個(gè)大分支中又分為不同的小分支，分離株ZJF株與安徽分離株Yan1屬于同一小分支，江淮地區(qū)以LH、SHFX1201株為代表的分離株處于一個(gè)小分支，歐洲標(biāo)準(zhǔn)株Virulent B株處于一個(gè)小分支，GDaGPV、SYG61v株處于一個(gè)小分支中，番鴨小鵝瘟SDHZ1604、JS1603株處于同一小分支中。VP1進(jìn)化樹見圖4。

圖4VP1基因進(jìn)化樹

3 討論

對(duì)華南地區(qū)一鵝場送檢的病料進(jìn)行常規(guī)處理后，通過鵝胚、鵝胚成纖維細(xì)胞進(jìn)行病毒分離、PCR方法進(jìn)行病毒鑒定分離到一株天然小鵝瘟毒株，命名為ZJF株。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明其為一株強(qiáng)毒。經(jīng)過全基因序列的測定分析，分離株ZJF株序列全長為5 046 bp，與江淮地區(qū)報(bào)道的LH、SHFX1201等基因全長基本相同，同源性也最高為98.2%～98.6%，與廣東地區(qū)早期GDaGPV分離株同源性較低為93.8%。分離株ZJF ITR區(qū)全長與江淮地區(qū)LH株、SHFX1201株相同，為414 bp，相較于歐洲標(biāo)準(zhǔn)株Virulent B株、GDaGPV有堿基的缺失，有報(bào)道稱ITR的長短與病毒的毒力有關(guān)，短的毒力為強(qiáng)毒株，長的為弱毒株，與本研究ZJF分離株病毒為強(qiáng)毒株相符合[4]。

ZJF分離株VP1進(jìn)化樹分析顯示，其與安徽分離株Yan1屬于同一小分支，江淮地區(qū)以LH、SHFX1201株為代表的分離株處于一個(gè)小分支，歐洲標(biāo)準(zhǔn)株Virulent B株處于一個(gè)小分支，GDaGPV、SYG61v株處于一個(gè)小分支中，番鴨小鵝瘟SDHZ1604、JS1603株處于同一小分支中，提示小鵝瘟的VP1基因存在抗原的多樣性。國內(nèi)對(duì)于水禽GPV全基因測序研究相對(duì)較少，導(dǎo)致GPV病毒基因分型較混亂，所以對(duì)GPV病毒進(jìn)行全基因序列的測定分析是十分有必要的。

ZJF分離株與廣東1978年分離的GDaGPV的進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，有可能廣東地區(qū)小鵝瘟毒株一直在持續(xù)的進(jìn)化，也有可能與本地雛鵝苗不足，大量外購?fù)獾伫Z苗，導(dǎo)致新的小鵝瘟毒株的傳入。