乳房炎奶牛血液中TNF-α、IL-1β及其mRNA表達水平的研究

楊麗華，韓一超，邱建東，董春光，韓文儒，劉文俊，陳劍波，武守艷

(1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西 太原 030032；2.太原市動物衛生監督所，山西 太原 030027)

奶牛乳房炎(Mastitis)是奶牛乳腺受到物理、化學、微生物等刺激所發生的一種炎性變化，是世界奶牛業的主要危害疾病之一。奶牛乳房炎可引起奶牛產奶量下降，牛乳品質發生改變，對奶牛危害很大，甚至危及人的健康。針對奶牛乳房炎，國內外有關人士進行了多年的研究，但到目前為止，奶牛乳房炎的發病機理、機體的變化情況尚未完全清楚。因此，研究奶牛乳房炎發病機理，尋找預防和治療的方法仍然是獸醫工作者的一個重要任務。

細胞因子是免疫系統有關細胞間相互作用的介質，它誘導、促進和調節免疫細胞活化、增殖、分化和表達，并且對機體免疫應答、免疫發生、免疫保護和免疫損傷效應的產生都具有重要作用[1]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為具有調節體內免疫功能和代謝過程的細胞因子，是機體感染炎癥及免疫應答體系和一系列病理生理過程的重要介質[2]。白細胞介素-1β(IL-1β)具有廣泛的生物學活性，它能誘導IL-6、TNF及其自身的分泌，并和TNF相互促進對方的釋放，在炎癥反應中起協同作用[3]。

目前，國內外對奶牛乳房炎研究的重點主要集中在對其致病菌的分離鑒定、奶牛乳房炎的病因探討和治療方面，對奶牛乳房炎血清中細胞因子水平的研究較少。本研究針對山西省規模化牛場臨床型乳房炎奶牛、隱性乳房炎奶牛和健康奶牛血液中的TNF-α、IL-1β含量及其mRNA基因表達進行測定，觀察乳房炎奶牛血液中上述細胞因子的變化規律及特點，旨在探討乳房炎奶牛血液成分的變化情況與奶牛乳房炎發生發展的相關性。

1 材料與方法

1.1 試驗動物選擇分組 隨機選取經產2～5胎、營養中等、處于泌乳期且患有臨床型乳房炎(無其他臨床疾病)的奶牛30頭作為臨床型乳房炎組(體細胞數>100萬個/mL)；將經產2～5胎，體重、泌乳期、產奶量相近，營養中等，全身狀況良好，無臨床癥狀，乳腺及乳汁無肉眼可見的臨床癥狀的隱性乳房炎奶牛30頭作為隱性乳房炎組(50萬個/mL <體細胞數<100萬個/mL)；符合上述要求的陰性奶牛30頭作為健康組(體細胞數<50萬個/mL)[4]。

1.2 血樣的采集與處理 試驗奶牛早晨飼喂前，用一次性使用靜脈血樣負壓采集管于被測奶牛頸靜脈處無菌采集抗凝血和非抗凝血。非抗凝血冰盒內靜置，待凝血后以3 000 r/min(4 ℃)離心15 min，分離血清，分裝于1.5 mL EP離心管中，放入 -20 ℃ 冰箱保存，用于血液細胞因子的檢測。抗凝血分離外周血單核細胞(PBMC)(具體方法詳見牛外周血淋巴細胞分離液KIT說明書)，在PBMC中加入TRIZol裂解液，裂解細胞后放入液氮中，然后轉移至-80 ℃冰箱保存，用于總RNA的提取。

1.3 ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1β的含量[5]檢測血清中TNF-α、IL-1β含量按照牛腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒說明書操作步驟進行。

1.4 乳房炎奶牛PBMC中細胞因子TNF-α和IL-1β mRNA表達量的測定 采用實時熒光定量PCR進行分析。用TRIZol方法提取PBMC總RNA。將置于-80 ℃冰箱凍存的PBMC細胞TRIZol裂解液取出在室溫下溶化，每1 mL TRIZol液加0.2 mL氯仿，在漩渦振蕩器上振蕩充分混勻，室溫靜置3 min，12 000 r/min(4 ℃)離心15 min。吸取上清液，轉移至另一EP管中，加入0.5 mL異丙醇，混合均勻后室溫放置10 min。12 000 r/min(4 ℃)離心10 min，棄上清。加入1 mL預冷的冰乙醇(70%)洗滌沉淀總RNA，10 500 r/min(4 ℃)離心10 min。此步驟可重復1～2次。棄去70%乙醇，經干燥后，加入50～100 μL DEPC處理過的水，4 ℃溶解，置于-80 ℃保存或用于后續試驗[6]。

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA的質量，Quawell Q500核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度和OD260/OD280值。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser對總RNA進行反轉錄。

根據NCBI公布的牛TNF-α、IL-1β和β-actin的mRNA序列，采用Primer 5.0軟件設計PCR擴增引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用RT-PCR對引物進行驗證[7]。

表1 引物序列

根據SYBR?PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)說明書，使用ABI PRISM 7 500 Real-time PCR System(ABI，USA)對TNF-α、IL-1β基因進行擴增。采用ΔΔCt法進行 qPCR 數據的處理，即在內參基因和目的基因擴增效率相同的情況下，目的基因的含量=2-ΔΔCt，其中，ΔΔCt=(CtTarget-CtActin)處理組-(CtTarget-CtActin)對照組，2-ΔΔCt表示試驗組目的基因與對照組的變化倍數。每個樣品重復3次。

2 結果與分析

2.1 各組試驗動物體細胞數結果 本試驗采用體細胞電子計數法對全場處于泌乳期的奶牛進行體細胞數檢測，各組奶牛體細胞數結果見表2。結果表明，各組間奶牛體細胞數差異顯著。

表2 各組奶牛體細胞數

*:P<0.05，**:P<0.01，下表同

2.2 各組奶牛血清細胞因子檢測結果 由表3可以看出，由于奶牛患有乳房炎，其血清中各種細胞因子的水平均發生了不同程度的變化，尤其以臨床型奶牛變化最為顯著。臨床型乳房炎奶牛組與健康奶牛組相比，血清中 TNF-α和IL-1β的含量均極顯著的升高(P<0.01)，分別升高了89.71%、82.06%；隱性乳房炎奶牛組與健康奶牛組相比，奶牛血清中TNF-α和IL-1β的含量均顯著的升高(P<0.05)，分別升高了62.31%、57.57%。

表3 各組奶牛血清中細胞因子

2.3 PBMC中TNF-α和IL-1β mRNA表達量的檢測

2.3.1 PBMC總RNA的提取與檢測 按照Invitrogen公司TRIZol說明書，對各個試驗組樣品進行總RNA的提取，用核酸濃度測定儀檢測RNA的濃度和完整性，結果顯示，樣品的OD260/OD280值都在1.8-2.0之間，表明RNA純度符合試驗要求。取適量的RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示，各樣品的總RNA 28 S、18 S和5.8 S條帶整齊清晰，帶與帶之間無拖尾現象，說明RNA比較完整，可以用于后續試驗。

2.3.2 熒光定量PCR引物驗證 以PBMC的cDNA為模板，各個基因相對應的特異性引物，進行普通PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。檢測結果如圖2所示，分別在約223 bp、104 bp和189 bp處獲得單一的亮帶，與預期的片段大小一致，無引物二聚體和其他非特異性條帶。

圖1 總RNA提取電泳圖

1-3：正常牛； 4-6：疾病牛

圖2 PCR產物電泳圖

1：DNA Marker; 2:TNF-α; 3:IL-1β； 4:β-actin

將普通PCR產物割膠回收，純化后的產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，3個基因的擴增片段所測序列，分別與NCBI數據庫核苷酸序列比對，結果顯示，與NCBI上公布的相對應基因序列相似性為98%以上。

2.3.3 熔解曲線分析驗證TNF-α和IL-1β熔解曲線如圖3、4所示 目的基因與內參基因Tm值均一，目的基因與內參基因的熔解曲線峰值分別單一，沒有引物二聚體和其他非特異性條帶的干擾。

圖3 目的基因TNF-α與內參基因β-actin的熔解曲線

圖4 目的基因IL-1β與內參基因β-actin的熔解曲線

2.3.4 乳房炎對PBMC中TNF-α和IL-1β mRNA表達量的影響 選用最佳反應體系，在相同條件下，對正常牛和疾病牛PBMC的TNF-α和IL-1β基因的表達量進行定量，通過β-actin校正，采用2-△△Ct對目的基因的表達量進行分析。如圖5所示，疾病牛與正常牛相比較，PBMC中TNF-α和IL-1β的mRNA表達量均顯著升高(P<0.05)。

綜上結果顯示，乳房炎奶牛血液中細胞因子TNF-α、IL-1β含量及mRNA表達水平均發生了不同程度的變化，尤其以臨床型奶牛變化最為顯著。綜合之前乳腺炎對奶牛血液常規指標及生化指標的試驗結果表明，奶牛乳房炎是一個全身性的病理過程，不僅乳腺組織遭到破壞，血液成分也發生了變化。臨床型乳房炎組奶牛比隱性乳房炎組奶牛血液成分變化明顯。臨床型乳房炎奶牛臨床癥狀明顯，感染嚴重，病程較長，營養不良，多項指標檢測結果均與此有關。依據血液指標及其動態變化情況，不僅可以用來判斷動物體內的各種生理活動和新陳代謝是否正常，也可以對獸醫工作者進行臨床診斷和治療提供重要的參考依據。

圖5 乳房炎對PBMC中TNF-α和IL-1β mRNA表達量的影響

3 討論

綜上所述，我們對規模化奶牛場乳房炎與細胞因子的關系做了一些研究，還處于初步試驗階段，乳房炎的免疫學機制復雜，對試驗結果有一定影響。確定乳房炎的特異性細胞因子還需要更全面、更深入的研究。研制出特異性細胞因子的預警手段，是下一步工作的重點。而且隱性乳房炎的診斷比較困難，研究一套全面完善的隱性乳房炎診斷方法，對于奶牛乳房炎的防治更具有臨床意義。所以在臨床實踐中，更應該加強對隱性乳房炎組奶牛血液成分的監測，及早發現問題，盡早隔離治療，防止疾病范圍的擴大。

引起奶牛乳房炎的病原微生物繁多，常常多種微生物混合感染，總之，預防奶牛乳房炎的發生應從加強飼養管理，完善奶牛場的綜合防制體系等入手，同時飼喂營養均衡的日糧，建立嚴格的衛生消毒制度，改善畜體環境，定期開展疫病監測[9]。提高隱性乳房炎的診斷率，并從環境衛生、飼養管理方面防制奶牛乳房炎，降低奶牛乳房炎的發病率，從而使奶牛場的經濟效益隨之提高。