重組產氣莢膜梭菌plc基因植物乳酸桿菌的免疫效果評價

張 艷，周慶民，馮萬宇，徐 馨，黃 健，王 新，李蘭蘭，王瑩瑩，鄭曉星，寧秀云，李廣興

(1. 黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030 ；3.黑龍江省訥河市動物防疫站，黑龍江 訥河 161300))

產氣莢膜梭菌(C.perfringens)又是一種革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，是人和動物腸道的常在菌，健康狀態下不發病，當胃腸道條件失衡時細菌大量繁殖致病。人們普遍認為其α毒素是引起家禽壞死性腸炎的主要致病因子[1-3]。α毒素是由370個氨基酸構成的單鏈多肽，分子量約43 kDa，包含2個結構功能區，具有磷脂酶C活性的氨基端和具有鞘磷脂酶活性羧基端[4-5]。α毒素依靠這兩種酶活性，水解組成細胞膜的主要成分膜磷脂，從而破壞細胞膜結構的完整性，導致細胞裂解[6]。

隨著養禽業中禁止使用抗生素，壞死性腸炎給國內外養禽業帶來了重大的經濟損失，所以本病的預防變得尤為重要。但行之有效的疫苗還沒有開發出來，所以我們利用植物乳桿菌(L.plantarum)作為呈遞α毒素plc片段的載體，制備口服重組活菌疫苗為壞死性腸炎疫苗的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、實驗動物與主要試劑 產氣莢膜梭菌ATCC13124株，購自上海天呈科技有限公司；植物乳桿菌NC8和產氣莢膜梭菌α毒素plc基因重組植物乳酸桿菌pSIP409-plc/L.plantarumNC8由本實驗室構建；pGEX-plc蛋白、兔抗產氣莢膜梭菌plc基因多抗和鼠抗產氣莢膜梭菌plc基因單抗由本實驗室制備。健康商品化白來航雛雞，購自哈爾濱成高子孵化場。HRP標記山羊抗兔IgG、FITC標記山羊抗兔IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；HRP標記山羊抗雞IgA，購自英國Abcam公司；其他試驗所用常規試劑為分析純。

1.2 動物試驗分組及菌液制備 免疫組：1日齡雛雞隨機分3組，24只/組，分別為空載體組(pSIP409/L.plantarumNC8)、plc組(pSIP409-plc/L.plantarumNC8)和PBS組，在7～28 d時分別連續以5×109CFU/mL菌液濃度灌胃免疫400 μL；攻菌組：1日齡雛雞隨機分成4組，18只/組，免疫方法同上，分別為空載體攻菌組、plc攻菌組、PBS攻菌組和PBS未攻菌組，免疫后在43～47 d時連續以5×108CFU/mL的A型產氣莢膜梭菌ATCC13124標準株菌液200 μL/只灌胃攻菌5 d。

乳酸菌菌液的制備：將pSIP409-plc重組乳酸菌和pSIP-409空載體乳酸菌分別接種于MRS液體培養基(含紅霉素終濃度為10 μg/mL)，30 ℃厭氧培養至OD600值=0.2-0.3 h加入SppIP誘導肽，終濃度為50 ng/mL，培養30 h后，5 000 r/min離心10 min，PBS重懸洗滌3次后，在菌體沉淀中加入適量PBS，調整菌液濃度大約為5.0×109CFU/mL；產氣莢膜梭菌ATCC13124標準株菌液的制備：A型產氣莢膜梭菌ATCC13124標準株按1∶100(v/v)接種于庖肉培養基，37 ℃培養24 h。PBS調整菌液濃度大約為5.0×108CFU/mL。

1.3 免疫雞腸道中分離plc陽性重組乳酸菌 于35 d剖殺3只雞/組，載玻片刮取小腸、盲腸段靠近黏膜的內容物生理鹽水沖洗，離心管中震蕩，混勻后涂含2%碳酸鈣的10 μg/mL Em+抗性MRS平板，厭氧培養48 h，挑取“溶鈣圈”明顯的菌落革蘭染色鑒定后進行純培養。菌液PCR方法對純化后的plc陽性重組乳酸菌進行鑒定。

1.4 間接免疫熒光法對免疫雞腸道中plc陽性重組乳酸菌的表達進行定位 于35 d剖殺3只雞/組，無菌分離十二指腸、空腸和盲腸段，制作冰凍切片，3% BSA中4 ℃封閉過夜，PBS洗片，兔抗產氣莢膜梭菌plc多抗血清用PBS進行1∶100倍稀釋后作為一抗，37 ℃孵育1 h；洗片，FITC標記羊抗兔IgG熒光抗體PBS 1∶200倍稀釋作為二抗，37 ℃孵育1 h；洗片，自然干燥后熒光顯微鏡觀察。

1.5 間接ELISA檢測免疫雞血清及多種體液中抗plc特異性抗體IgG/sIgA效價 純化后的plc蛋白0.1 μg/孔，收集免疫期間每7 d和攻菌后1、3、5、7、14、21 d的血清、糞便裂解液、支氣管肺泡沖洗液、小腸洗液和膽汁稀釋后作為一抗，同時加入PBS陰性對照，HRP標記的山羊抗雞IgG/IgA稀釋作為二抗，按常規ELISA步驟進行操作，測定OD490值吸光度。

1.6 攻菌后各組雞小腸內細菌定植檢測 攻菌后的1、3、5、7 d，每組剖殺3只雞分別對十二指腸、空腸的卵黃憩室和回盲腸接口處進行TSC卵黃瓊脂平板細菌分離并計數，檢測免疫組和對照組腸道的梭菌數評價其免疫保護水平。

1.7 病理組織學檢查與腸道病變評分

1.7.1臨床癥狀觀察 在免疫與攻菌期間密切觀察各組的采食、飲水、排便情況以及雞群的精神狀態，進行記錄。

1.7.2 病理切片制備 免疫組在免疫前及14、28、35、42、56 d，攻菌組在攻菌后1、3、5、7、14、21 d，每組隨機取3只雞進行病理剖檢。取胸腺、脾臟和腔上囊、回腸、空腸、十二指腸、肝臟、心臟、腎臟和肺臟等組織器官固定后H.E.染色制作病理切片。

1.7.3 攻菌組腸道病變評分 攻菌后1、3、5、7、14、21 d，每組隨機取3只雞病理剖檢。檢測攻菌后各組雞十二指腸至回腸部的可見病變。小腸病變指數按照1979年Prescott的病變指數標準進行評定[3]，0：無大體病變；1+：小腸管壁變薄變脆；2+：局灶性壞死或潰瘍；3+：大面積壞死；4+：嚴重或大范圍的典型壞死。計算腸道病變指數平均分。

1.8 免疫及攻菌對雛雞體重和免疫器官發育的影響 于免疫前、免疫期間每7 d及連續攻菌后每7 d記錄各組雞體重，計算各組雞體重變化。免疫組分別于免疫后每7 d，攻菌組分別于攻菌后1、3、5、7、14 d和21 d，各剖檢3只雞，分離出胸腺、脾臟和腔上囊，吸干水分，稱重。免疫器官指數(%)=免疫器官重(g)/雞只活體重(g)×100 %。

1.9 數據分析 采用GraphPad Prism 5軟件對數據進行雙因素方差分析和Duncan′s多重比較。

2 結果

2.1 重組植物乳桿菌在免疫雞腸道定植情況

2.1.1 免疫雛雞腸道分離乳酸菌，厭氧培養48 h后，與對照組不同的是plc組和空載體組平板上有更多白色不透明的小圓形菌落，且菌落四周可見碳酸鈣溶解產生的透明圓圈，鏡檢為革蘭陽性桿菌，將純培養的菌液進行PCR，plc組分離的乳酸菌在預計位置1 134 bp處出現目的條帶。所以，結果顯示在免疫雞腸道分離到了我們的重組乳酸菌，說明重組乳酸菌可以在雞腸道存在一段時間。

2.1.2 間接免疫熒光法對雞腸道中重組乳酸菌的表達進行定位，plc免疫組雞腸道多數腸段腸絨毛周圍均顯示出黃綠色熒光(見中插彩版圖1-A、B和C)，其中盲腸和空腸處熒光信號最強，十二指腸熒光信號較弱；而免疫含有空載體的植物乳桿菌和PBS對照組腸道絨毛沒有顯示出綠色熒光(見中插彩版圖1-D、E和F)。

2.2 雛雞免疫后抗產氣莢膜梭菌plc抗體動態變化 免疫后IgG(圖2-A)和sIgA(圖3)抗體效價水平。免疫前抗體水平基本一致(P>0.05)，免疫后plc組顯著持續上升，空載體組略有上升，而PBS組無變化，免疫后7d開始plc組與其他組差異極顯著(P<0.01)。

圖2 免疫組(A)和攻菌組(B)雛雞血清中抗C.Perfringens plc IgG抗體動態變化

圖3 免疫組雛雞各體液中抗C.Perfringens plc sIgA抗體動態變化

2.3 雛雞攻菌后抗產氣莢膜梭菌plc抗體動態變化 plc攻菌組在攻菌后7 d IgG抗體水平達到最高(圖2-B)；各體液中PBS攻菌組的sIgA抗體水平都明顯低于plc攻菌組(P<0.01)。糞便裂解液、支氣管肺泡液中plc攻菌組在攻菌后5 d達到最高，小腸洗液中plc攻菌組在攻菌后7 d達到最高，膽汁中plc攻菌組在攻菌后初期稍有下降，但后期重新升高(圖4)。

2.4 攻菌后細菌分離、計數結果 分離到長出帶有透明圓環的黑色圓菌落。鏡檢為革蘭陽性桿菌，菌體兩端鈍圓，單個或成雙排列，偶見鏈狀。總的來看(圖5)，plc攻菌組檢出水平最低(P<0.01)?；孛つc接口處空載體和PBS攻菌組細菌數量持續上升，在攻菌后5 d達到最多(P<0.01)且比其他幾處都多，而此時plc攻菌組細菌數量開始下降，說明重組菌的免疫可減少其在腸道定植；卵黃憩室處攻菌后5 d時細菌數最多，在攻菌后7 d時空載體和PBS攻菌組細菌數仍然很多(P<0.01)，而此時plc攻菌組細菌數開始減少；所有組別細菌數在十二指腸處最少。

圖4 攻菌組雛雞各體液中抗C.Perfringens plc sIgA抗體動態變化

圖5 攻菌后產氣莢膜梭菌分離計數結果(log10)

2.5 攻菌后各組病理剖檢變化 攻菌3 d時PBS攻菌組開始排黃褐色稀便，隨攻菌的持續，出現精神沉郁、嗜睡、食欲減退等現象。整體看，各組攻菌后1 d和3 d剖檢病變輕微，5 d時最重，7 d后逐漸減輕。

2.6 病理組織學變化

2.6.1 免疫組雛雞組織器官的病理組織學變化 病理組織學檢查顯示，免疫前后各組織器官健康狀況良好，乳酸菌的免疫并沒有對組織器官造成損害(見中插彩版圖6)。21 d前各組無明顯差異，28 d見plc組腸絨毛排列整齊致密，且絨毛長于其他組，隱窩深度略有下降，固有層淋巴細胞增多，十二指腸和空腸孤立淋巴小結及回腸集合淋巴小結增多。

2.6.2 攻菌組雛雞組織器官的病理組織學變化 心臟：PBS和空載體攻菌組攻菌后5～7 d心肌顆粒變性明顯，可見毛細血管擴張、充血，內皮細胞腫脹，心肌纖維變性壞死，彌散性出血，核淡染，肌纖維間距變大，肌束斷裂或溶解(見中插彩版圖7-A/B)；14～21 d心外膜內淋巴細胞和巨噬細胞增多。plc攻菌組5～7 d心肌纖維腫脹，淋巴細胞和巨噬細胞增多，心肌纖維間散在紅細胞；14～21 d心臟組織結構基本恢復。

肝臟：PBS和空載體攻菌組攻菌后5～7 d胞漿空泡化，核裂解，淋巴細胞和巨噬細胞顯著增多，中央靜脈和小葉間靜脈擴張、充血，內皮腫脹，多量紅細胞彌散于組織間隙(見中插彩版圖7-C)。14～21 d病變減輕。plc攻菌組5～7 d竇狀隙擴張，淋巴、巨噬、紅細胞增多，核淡染(見中插彩版圖7-D)；14～21 d無明顯病變。

腎臟：PBS和空載體攻菌組攻菌后5～7 d腎小球、腎小管上皮腫脹，間質內出血、水腫(見中插彩版圖8-A)；14～21 d間質內淋巴細胞和巨噬細胞增多。plc攻菌組5～7 d間質內大量炎性細胞浸潤(見中插彩版圖8-B)；14～21 d病變減輕，僅腎小球腎小管輕度腫脹。

脾臟：PBS和空載體攻菌組攻菌后5～7 d病變加重，核濃縮或崩解，紅髓血量減少，嗜酸性粒細胞浸潤，白髓內淋巴細胞排列疏松，組織間見大量紅細胞(見中插彩版圖8-C)；14～21 d淋巴細胞增多。plc攻菌組5～7 d少量嗜酸性粒細胞浸潤，淋巴細胞略少；14～21 d紅髓血量增多，淋巴生發中心明顯。

腔上囊：PBS和空載體攻菌組攻菌后5～7 d淋巴細胞數量顯著減少，核濃縮或碎裂，局部現小壞死灶，間質內見大量紅細胞(見中插彩版圖8-D)；14～21 d間質內少量淋巴細胞、巨噬細胞和嗜酸性粒細胞浸潤。plc攻菌組5～7 d間質內有少量淋巴細胞浸潤和散在的紅細胞，核深染；14～21 d無明顯可見病理變化。

空腸：PBS和空載體攻菌組攻菌后5～7 d腸絨毛溶解斷裂，黏膜上皮變性壞死、脫落，黏膜層變薄，杯細胞增多，固有層水腫，黏膜上皮與固有層間隙增寬，黏膜下層出血嚴重(見中插彩版圖9-A)；14～21 d絨毛溶解減輕，黏膜上皮細胞增生，杯細胞增多。plc攻菌組5～7 d黏膜上皮細胞增生，杯細胞增多，偶見腸絨毛上皮細胞溶解(見中插彩版圖9-B)；14～21 d杯細胞稍多。

回腸：PBS和空載體組攻菌后5～7 d腸絨毛結構不完整，固有層明顯的出血或瘀血，柱狀細胞排列紊亂，絨毛嚴重斷裂、脫落、自溶，杯細胞增多、破裂，黏液量增多(見中插彩版圖9-C)；14～21 d絨毛組織結構模糊，仍可見黏膜上皮細胞增生。plc攻菌組5～7 d固有層中淋巴細胞大量增殖，淋巴小結數量增多，可見少量腸絨毛上皮細胞脫落，固有層輕微出血，杯細胞增多但少于PBS和空載體攻菌組；14～21 d絨毛形態較完整，固有層中淋巴細胞增多(見中插彩版圖9-D)。

十二指腸：PBS和空載體組攻菌后5～7 d絨毛結構不完整，排列紊亂，核濃縮、結構模糊或溶解消失，部分絨毛脫落，黏膜下層淋巴細胞、巨噬細胞增多，組織間見多量紅細胞，杯細胞增多(見中插彩版圖9-E)；14～21 d漿膜層內淋巴細胞和巨噬細胞浸潤，黏膜上皮細胞增生。plc攻菌組5～7 d杯細胞增多，偶見絨毛頂端溶解；14～21 d十二指腸結構基本完整(見中插彩版圖9-F)。

PBS未攻菌組在各組織器官中均未見病變。

2.7 重組植物乳酸桿菌免疫雛雞攻菌后腸道病變評分 plc攻菌組(1.00±0.91Bb)<空載體攻菌組(2.06±0.87Aa)

2.8 重組植物乳酸桿菌免疫及攻菌對雛雞體重的影響 免疫組體重變化規律(圖10-A)：plc組的體重和平均日增重量在各個監測點均高于其他組，且在35 d開始與其他組差異極顯著(P<0.01)；空載體組增長雖不如plc組明顯，但仍比PBS組明顯，且在49 d時與PBS組差異極顯著(P<0.01)。攻菌組(圖10-B)總趨勢還是plc攻菌組體重最高，從攻菌后7 d開始PBS攻菌組明顯下降(P<0.01)；plc攻菌組日增重量初期略有下降，比PBS未攻菌組還低，但是在攻菌后14 d又再一次高于其他組，且一直保持到最后一個監測點。

圖10 免疫組(A)及攻菌組(B)雛雞體重的動態變化

2.9 重組植物乳酸桿菌免疫及攻菌對雛雞免疫器官發育的影響 免疫開始前各免疫器官指數分別沒有差別(P>0.05)，胸腺指數在免疫結束時才明顯上升；脾臟和腔上囊指數在49 d達最高。綜合來看，plc組各指數最高，與其他組差異極顯著(P<0.01)(圖11)。

圖11 免疫后雛雞各免疫器官指數

總體看攻菌后各指數上升趨勢變緩，plc攻菌組各免疫器官指數與其他各組差異極顯著(P<0.01)。plc攻菌組胸腺指數在攻菌后7 d時恢復上升；plc攻菌組脾臟指數在攻菌后14 d降至最低，隨后又上升(圖12)。

圖12 攻菌后雛雞各免疫器官指數

3 討論

雛雞免疫保護試驗檢測結果可以看出重組菌對腸道產氣莢膜梭菌的攻擊起到了較好的保護作用，而空載體乳酸桿菌和PBS免疫組沒有起到保護作用。 攻菌保護試驗病理組織學檢查表明，各器官病理組織學變化與產氣莢膜梭菌感染的病變特點相符，病變較明顯的是在小腸段，結果顯示，plc攻菌組的病變程度比PBS和空載體組輕，這可以說明我們的重組菌對雛雞的腸道起到了一定的保護作用。另外，試驗結果顯示，乳酸桿菌免疫組腸道組織切片中絨毛高度增加，隱窩深度降低。原因可能是乳酸桿菌能增強腸道中有機成分的溶解和吸收，避免其對腸道的直接刺激作用，進而降低腸道的損傷。增加了腸道中有益菌群可以減少有害菌群的繁殖，從而保障雛雞腸道健康發育，增強雛雞腸道對營養物質的消化、吸收能力。腸道病變評分結果顯示，重組菌免疫后攻菌組雞腸道損傷較輕，PBS攻菌組腸道損傷最嚴重；而PBS未攻菌組雞腸道未見損傷。小腸產氣莢膜梭菌分離結果表明，plc攻菌組與空載體和PBS攻菌組相比，小腸中產氣莢膜梭菌檢出水平較低，與腸道病變評分結果相呼應。plc攻菌組產氣莢膜梭菌檢出量比PBS攻菌組低的原因可能是重組菌在雞腸道中的定植構成產氣莢膜梭菌的空間位阻。

體重監測結果表明，免疫期間plc組的增重最高，其次是空載體組，最低的是PBS組。攻菌后體重差異總體趨勢與免疫組基本一致，區別是PBS未攻菌組高于攻菌后的PBS組和空載體組，但是重組菌免疫后攻菌組體重還是明顯高于PBS未攻菌組。攻菌后與攻菌前各組的平均日增重量相比有所下降，可能是因為產氣莢膜梭菌對腸道的攻擊影響了動物的食欲和腸道對營養的吸收。免疫器官指數計算結果表明，乳酸桿菌組的免疫器官指數都高于PBS組，且攻菌后重組菌的免疫器官指數還能高于PBS未攻菌組。胸腺、脾臟和腔上囊是禽類最主要的免疫器官，不僅參與機體的體液免疫和細胞免疫，而且它們的發育狀態決定著機體的免疫水平。

整體評價重組菌的免疫效果，表明其能夠在雞腸道良好定植并減少產氣莢膜梭菌的定植，誘導機體免疫應答，從而減輕腸道損傷，減緩腹瀉癥狀，提高飼料利用率，提高雞只的增重，對產氣莢膜梭菌感染有良好保護作用。