不同時段運動干預(yù)對CUMS模型大鼠血清5-羥色胺、皮質(zhì)酮含量的影響

侯玉寧，高思楠，栗曉茹，孔 凡，李 喆，賈 怡，張 波，韓雨梅

前言

抑郁癥是一種高患病率、高疾病負(fù)擔(dān)、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高自殺率的慢性精神疾病。預(yù)計到2020年，重型抑郁所導(dǎo)致的功能殘疾將僅次于缺血性心臟病，居第2位[1]。關(guān)于抑郁癥的假說包括單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其受體假說、下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸紊亂假說、神經(jīng)營養(yǎng)因子假說、細(xì)胞因子假說、線粒體功能異常假說等等，其中第一、二種假說已得到了大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可，所以本研究就以這兩個假說中的常用指標(biāo)作為判定抑郁癥的依據(jù)，即5-羥色胺和皮質(zhì)酮。同時針對以上假說，研究者也提出了很多相關(guān)的治療方法，包括藥物治療、心理治療和運動治療方法等等，其中運動治療已被公認(rèn)是一種良好輔助療法，可以緩解焦慮、抑郁等精神癥狀[2]。然而目前關(guān)于不同時段運動干預(yù)對抑郁癥治療效果和作用機制的研究較少，因此本研究旨在以抑郁癥大鼠為模型，設(shè)計兩種不同的運動方案(即預(yù)運動方案和應(yīng)激后運動方案)，探討它們對抑郁癥行為學(xué)指標(biāo)和生化指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

成年雄性SD大鼠32只(山西大學(xué)實驗動物中心提供)，體重177～200g，飼養(yǎng)環(huán)境：室內(nèi)溫度20-25℃，濕度50%～60%，自由飲食。實驗過程中對動物的處置參照國家科學(xué)技術(shù)部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。所有動物適應(yīng)飼養(yǎng)1周，在此期間對所有SD大鼠進行蔗糖溶液消耗訓(xùn)練，1周后測定SD大鼠的體重、1%蔗糖溶液消耗量，測完之后將實驗大鼠隨機分為成空白對照組(C)、應(yīng)激組(S)、預(yù)運動應(yīng)激組(ESE)和應(yīng)激運動組(SE)，每組8只。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激模型的建立

在各組大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練1周后，對S組、 ESE組、SE組實施禁食(24h)、禁水(24h)、冰水游泳(4℃，5min)、熱應(yīng)激(50℃，10min)、夾尾(止血鉗，距尾根1cm，2min)、電擊足底(電壓40v，每次10s，間隔50s刺激1次，共30次)、噪音刺激(3 h)。共7種刺激方式，每天1種，每種刺激隨機實施3～4次，持續(xù)4周 (ESE組在接受刺激同時要進行運動干預(yù))[3]，C組正常飼養(yǎng)。

1.2.2 運動方案的設(shè)定

1.3 動物行為學(xué)指標(biāo)測定

1%蔗糖溶液消耗量：測定前禁水、禁食 24h，每周四晚18：00-19：00 測定動物1h飲用1%蔗糖溶液的量。測定前、后水瓶的重量差為動物1h飲用1%蔗糖溶液的量。1%蔗糖溶液消耗量以1h攝入1%蔗糖溶液的量(mg)/動物體重(g)進行評定。[5]

1.4 組織樣品制備及測定方法

1.4.1 皮質(zhì)酮制備及測定方法

對各組SD大鼠進行斷頭取血，將其血液放置在20μl/ml全血的采血管(含有0.3M ml/lEDTA-2Na 溶液抗凝劑)內(nèi)，攪拌均勻后快速離心20min，取血漿低溫保存，待測。測定步驟：(1)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50μl。(2)在樣本孔中分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)，將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不要觸及孔壁，要輕輕晃動混勻。(3)每孔加入酶標(biāo)試劑100μl(除了空白孔)。(4)用封板膜封板后置 37℃溫育箱中60分鐘。(5)配液：將20倍濃縮洗滌液用20倍蒸餾水稀釋之后備用。(6)小心揭掉封板膜，棄去液體，并甩干，之后將每個孔都加滿洗滌液，在靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。(7)每個孔都先加入顯色劑A50μl，然后再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，在37℃避光處顯色15分鐘。(8)每個孔都加終止液50μl，進行終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。(9)用熒光分光光度法進行測定(測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行)。(10)通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠皮質(zhì)酮含量。

1.4.2 5-羥色胺制備及測定方法

制備5-羥色胺的方法與皮質(zhì)酮的制備方法相同。測定方法:采用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠5-羥色胺水平。用純化的大鼠5-羥色胺捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入大鼠5-羥色胺，再與HRP標(biāo)記的檢測抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB 在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠5-羥色胺呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定光度(OD值)，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠5-羥色胺含量。

1.5 數(shù)據(jù)的處理

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果

2.1.1 各組大鼠體重結(jié)果

圖1顯示，應(yīng)激前各組大鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。應(yīng)激4周后，與C組相比，S組、ESE組、SE組體重低于C組，差異非常顯著(P<0.01)，而S組、ESE組、SE組之間體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。運動干預(yù)4周后，S組、ESE組、SE組體重低于C組，差異非常顯著(P<0.01)，而S組與SE組無顯著差異(P>0.05)，與ESE組有顯著差異 (P<0.05)，同時SE組和ESE組體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。

圖1 各組大鼠體重比較(n=8)

注：與C組比較，#p<0.05，##p<0.01；與S組比較，*p<0.05，**p<0.01；與SE組比較，$P<0.05,$$P<0.01。

2.1.2 各組大鼠糖水消耗結(jié)果

圖2顯示，應(yīng)激前各組大鼠糖水消耗量無顯著差異(P>0.05)。應(yīng)激4周后，S組、ESE組、SE組糖水消耗量低于C組，差異非常顯著(P<0.01),而S組、ESE組、SE組之間無顯著差異(P>0.05)。運動4周后，與C組相比，S組與其差異非常顯著(P<0.01),ESE組和SE組與其無明顯差異(P>0.05)；與S組相比， ESE組與其差異非常顯著(P<0.01)，SE組與其有顯著差異(P<0.05)；ESE組和SE組無顯著差異(P>0.05)。

圖2 各組大鼠糖水消耗量比較(n=8)

注：與C組比較，#p<0.05，##p<0.01；與S組比較，*p<0.05，**p<0.01；與SE組比較，$P<0.05,$$P<0.01。

2.2 血漿皮質(zhì)酮、5-羥色胺測定結(jié)果

2.2.1 各組大鼠皮質(zhì)酮測定結(jié)果

圖3顯示，實驗結(jié)束后，與C組相比，S組皮質(zhì)酮含量遠(yuǎn)高于C組,差異極其顯著(P<0.001)，而ESE組和SE組與其無顯著差異(P>0.05)；與S組相比，SE組與其有極其顯著的差異(P<0.001),ESE組與其有非常顯著的差異(P<0.01);ESE組與SE組無顯著差異(P>0.05)。

注：與C組比較，#p<0.05，##p<0.01，###P<0.001；與S組比較，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001；與SE組比較，$P<0.05,$$P<0.01。

2.2.2 各組大鼠5-羥色胺測定結(jié)果

實驗結(jié)束后，與C組相比，S組血漿5-羥色胺含量遠(yuǎn)低于C組，差異非常顯著(P<0.01),而ESE組和SE組與其無顯著差異(P>0.05)；與S組相比，ESE組和SE組與其有顯著差異(P<0.05)；ESE組和SE組之間無顯著差異(P>0.05)。

圖4 各組大鼠5-羥色胺含量比較(n=8)

注：與C組比較，#p<0.05，##p<0.01；與S組比較，*p<0.05，**p<0.01；與SE組比較，$P<0.05,$$P<0.01。

3 討論

3.1 行為學(xué)指標(biāo)測試結(jié)果分析

Willner等人建立的CUMS模型大鼠對于研究抑郁癥有著重大的意義。研究表明該模型較真實地模擬了抑郁癥病人的某些病因和癥狀，如在行為上CUMS模型大鼠會出現(xiàn)食欲不振、興趣減退、快感缺失、反應(yīng)遲鈍、行為緩慢等與人相似的抑郁表現(xiàn)；在神經(jīng)系統(tǒng)上會引起血漿中5-羥色胺濃度下降，皮質(zhì)酮濃度升高等指標(biāo)變化[6]，因此該模型為本研究提供了實驗的基礎(chǔ)。根據(jù)CUMS模型大鼠外顯的行為表現(xiàn)，研究者通常把其體重和糖水消耗量作為測量其抑郁程度的行為指標(biāo)，研究顯示體重的改變來自于應(yīng)激大鼠情緒低落和進食較少的影響[7]；而糖水消耗實驗是根據(jù)動物對甜味的偏好而設(shè)計的一種檢測方法，當(dāng)大鼠出現(xiàn)抑郁行為時，其對糖水的偏嗜度會降低(模仿了人的快感缺失即體驗快樂的能力下降，是精神疾病及行為障礙的重要特征)[8]。因此本實驗在造模前后，對參與實驗的大鼠的這兩類指標(biāo)進行了檢驗。結(jié)果顯示，在造模4周后，S組、ES組、ESE組的體重和糖水消耗量顯著低于C組(P<0.01)，說明本實驗成功地復(fù)制了CUMS模型大鼠。在運動干預(yù)4周后，ESE組、SE組和S組的體重?zé)o顯著差異(P>0.05)，提示經(jīng)常規(guī)律性地參加有氧運動,可以有效地控制機體能量消耗和減少能量攝入[9]。ESE組、SE組和S組相比，糖水消耗量有極顯著差異(P<0.01)，說明適宜的有氧運動對抑郁癥有一定的緩解作用。實驗結(jié)果還顯示ESE組和SE組無論是體重還是糖水消耗量上都無顯著差異(P>0.05)，提示預(yù)運動方案和應(yīng)激運動方案的治療效果相近。但從這兩組大鼠行為指標(biāo)具體數(shù)據(jù)上來看，ESE組無論是體重還是糖水消耗量值都要高于SE組并且更加接近C組水平，提示預(yù)運動方案的治療效果可能會更好。

3.2 皮質(zhì)酮含量測試結(jié)果的分析

研究表明，目前單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說和下丘腦—垂體—腺皮質(zhì)軸紊亂假說得到了大家的一致認(rèn)可，它們的病理機制分別是：(1)單胺類假說認(rèn)為抑郁癥的發(fā)生主要是由于去甲腎上腺素(noradrenaline,NA)、5-羥色胺(5- hydroxytryptamine ,5-HT)、多巴胺(dopamiire,DA)等神經(jīng)遞質(zhì)水平過低及其受體功能低下和神經(jīng)突觸間的神經(jīng)遞質(zhì)濃度較低造成的。其中研究表明，5-HT系統(tǒng)調(diào)節(jié)著動物的情緒、動機、食欲等，當(dāng)5-HT1a和5-HT2a受體功能相互拮抗，兩者功能不平衡會導(dǎo)致抑郁，同時當(dāng)突觸前5-HT自身受體功能亢進時也可導(dǎo)致抑郁[10]。(2)下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸紊亂假說認(rèn)為HAP軸失調(diào)是抑郁癥的主要標(biāo)志。因為在已知正常情況下，HPA軸的軸心下丘腦的室旁核(paraventricular nucleus, PVN) 分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子/激素(corticotrophin -releasing factor/hormone, CRF/H)和精胺酸血管加壓素(arginine vasopressin, AVP)刺激腺垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素 (adrenocorticotropic hormone, ACTH)， 進而促進腎上腺分泌糖皮質(zhì)激素(主要是皮質(zhì)醇), 而皮質(zhì)醇、ACTH的增多會負(fù)反饋抑制CRF和AVP的合成和釋放,從而確保各激素保持在適度水平。當(dāng)患抑郁癥時下丘腦異常活動會增加, PVN會分泌過多的CRF，從而刺激垂體分泌過多的ACTH, ACTH刺激腎上腺皮質(zhì)分泌過多的皮質(zhì)激素, 使整個HAP軸處于過度活動的狀態(tài)[11],其中皮質(zhì)酮是一種皮質(zhì)激素類二十一碳甾體激素，由腎上腺的皮質(zhì)產(chǎn)生出來，當(dāng)人患有抑郁癥狀時會使血液中皮質(zhì)酮持續(xù)升高，引起血液中糖皮質(zhì)激素積累，造成內(nèi)分泌代謝過分增加[12]。因此綜上所述，本實驗采用以上兩個假說中最有代表性的生化指標(biāo)來判定CUMS大鼠抑郁程度(即血漿皮質(zhì)酮和5-HT)。研究結(jié)果顯示，C組血漿皮質(zhì)酮含量遠(yuǎn)低于S組(P<0.01)，這更有力證明了本實驗CUMS模型大鼠的制備比較成功；ESE組、SE組與C組相比無顯著差異(P>0.05)，與S組有顯著差異(P<0.05),結(jié)果與相關(guān)文獻[13]報道相吻合，說明適度有氧運動可以合理調(diào)節(jié)皮質(zhì)酮的釋放，能抵抗糖皮質(zhì)激素過量分泌，從而使得血漿皮質(zhì)酮含量降低甚至接近正常水平，從而緩解抑郁癥狀。結(jié)果還顯示，SE組血漿皮質(zhì)酮含量和ESE組無顯著差異(P>0.05)，說明這兩種運動方案治療抑郁癥的效果無太大差異。

3.3 血漿5-羥色胺測試結(jié)果的分析

5-羥色胺是評定CUMS模型大鼠抑郁程度的另一生化指標(biāo) ，又名血清，廣泛存在于哺乳動物組織中，特別在大腦皮層質(zhì)及神經(jīng)突觸內(nèi)含量很高，它也是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。當(dāng)其在外周組織時，5-羥色胺是一種強血管收縮劑和平滑肌收縮刺激劑；當(dāng)其作為神經(jīng)遞質(zhì)時，主要分布于松果體和下丘腦，參與痛覺、睡眠和體溫等生理功能的調(diào)節(jié)，所以當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT含量及功能異常時，人可能會出現(xiàn)抑郁和偏頭痛等多種疾病[14]。本研究結(jié)果顯示，S組血漿5-羥色胺含量顯著低于C組(P<0.01)，而ESE組和SE組的要顯著高于S組(P<0.05)，并接近C組(P>0.05)。這首先說明慢性中等不可預(yù)知性應(yīng)激刺激可降低腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，導(dǎo)致中樞單胺能系統(tǒng)功能障礙，促發(fā)抑郁情緒，這與以往的研究相一致；其次說明適當(dāng)有氧運動有助于減緩和恢復(fù)處于抑郁狀態(tài)中中樞單胺遞質(zhì)的含量，可抵抗應(yīng)激，促進抑郁癥的康復(fù)。實驗結(jié)果還顯示ESE組5-羥色胺含量與SE組無顯著差異(P>0.05)，說明預(yù)運動方案與運動應(yīng)激方案的治療效果無差異。但從具體數(shù)值來看，ESE組5-羥色胺濃度更接近正常組水平，提示預(yù)運動應(yīng)激方案有更好地治療趨勢。

4 小結(jié)

綜上所述，本實驗的行為學(xué)指標(biāo)和生化指標(biāo)，都表明適宜的有氧運動對抑郁癥有明顯拮抗作用，且和以往的研究結(jié)果一致，說明有氧運動可以有效地治療抑郁癥。同時本實驗結(jié)果顯示ESE組和SE組的CUMS模型大鼠在行為學(xué)上和生化上的相關(guān)指標(biāo)都無明顯差異，說明預(yù)運動方案和應(yīng)激后運動方案在治療抑郁癥的效果無顯著差異，我們推測這種結(jié)果可能是由于預(yù)運動方案在模型大鼠應(yīng)激前的運動干預(yù)時間不足所致。同時綜合ESE組體重、糖水消耗量、5-色胺濃度變化均比SE組更加接近對照組水平，提示如果應(yīng)激前期運動時間充足，預(yù)運動方案對抑郁癥康復(fù)可能有更好的治療趨勢。

5 結(jié)論

5.1 適宜的有氧運動能夠改善抑郁癥模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)以及血漿皮質(zhì)酮和5-羥色胺含量。

5.2 不同時段的運動方案在改善模型大鼠的抑郁癥狀方面無顯著差異，可能與應(yīng)激前運動時間的長短有關(guān)。