園林廢棄物中高效降解菌的分離與鑒定

周童 袁澤斌 萬可 牟昌紅 王從梅 歐陽秀琴 王波

摘 要：為了更好地對園林廢棄物進行資源化利用，試驗以堆肥腐熟后的園林廢棄物作為供試材料，進行其菌株的分離和鑒定。通過細菌16S rDNA測序分析，鑒定出21株細菌，分屬于3門5綱7目10科13種，其中，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）分別鑒定出4種、6種和3種；通過真菌rDNA ITS 測序分析，鑒定出9株真菌，分屬于1門（子囊菌門）2綱2目2科3屬5種，其中青霉菌屬（Penicillium）鑒定出3種，曲霉屬（Aspergillus）和短梗霉屬（Aureobasidium）各鑒定出1種。

關鍵詞：園林廢棄物；菌株；分離；鑒定

中圖分類號：S961.6 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.10.001

Abstract： In order to make better use of garden wastes， the experiment was conducted to isolate and identify the strains from the garden wastes composting. According to the bacterial 16S rDNA sequencing analysis， 21 bacteria strains were identified， which were belonged to 3 phyla， 5 classes， 7 orders， 10 families and 13 species. Among the three phyla， the bacteria of Firmicutes， Proteobacteria， Actinobacteria were identified 4 species， 6 species， and 3 species， respectively. According to fungal rDNA ITS sequencing analysis， 9 fungi strains were identified， which were belonged to 1 phylum （Ascomycota）， 2 classes， 2 orders， 2 families， 3 genuses， 5 species. Among the three genuses， the fungi of Penicillium， Aspergillus， and Aureobasidium were identified 3 species， 1 species， and 1 species， respectively.

Key words： garden waste； strains； isolation； identification

隨著城市綠化建設的飛速發展以及人們對生態環境要求的提高，園林廢棄物的數量快速增加，焚燒、填埋、粉碎粗回收等非資源化的處理方式既帶來了嚴重的環境問題[1]，同時也造成了資源的浪費。大多數園林廢棄物含有豐富的有機質，部分地區通過堆肥使其形成基質重新應用于園林和城市綠化，對土壤有很好的改良作用，是一種變廢為寶的科學手段，一方面降低了對自然環境的污染，另一方面也節約了資源，是一種適合可持續發展的處置方式。

目前，處理園林廢棄物堆肥的主要模式是參照農業廢棄物的堆肥方式，然而，相較于一般的農業廢棄物，園林廢棄物中有更加豐富的、難以降解的木質纖維素，主要存在于植物細胞壁的微管組織中，纖維素分子鏈聚集成的微纖絲相互交織鑲嵌排列形成結晶相和非結晶相，該結構具有超強的防御作用，化學試劑難以有效接觸纖維素表面[2]，降解速率低，嚴重阻礙以園林廢棄物為原料的堆肥處理進程。

芽孢桿菌、諾卡氏菌、高溫放線菌、黑曲霉、青霉等微生物均具有木質纖維素降解能力[3]，可提高木質纖維素降解速率，因此，高效降解纖維素的微生物菌株篩選對園林廢棄物高效資源化利用意義重大。

試驗對腐熟的園林廢棄物進行微生物分離實驗以及分子生物學鑒定，獲得園林廢棄物腐熟過程中的細菌和真菌信息，旨在為具有纖維素降解能力的菌株篩選提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

腐熟材料是不同植物枝葉的混合物，取自常州新北區園林綠化服務處。

1.2 試驗儀器

高壓滅菌鍋（MLS-3780）、人工氣候箱（韶關市泰宏醫療器械有限公司生產）、電子天平（梅特勒-托利多EL303）、恒溫培養振蕩器（ZD-810，上海精宏實驗設備有限公司生產）、pH計（梅特勒-托利多S220）、高速臺式離心機（TDL-8-AC，上海安亭科學儀器廠生產）、超凈試驗臺（SW-CJ-1F，蘇州尚田潔凈技術有限公司生產）。

1.3 培養基及配置

1.3.1 改良高氏1號培養基（培養真菌） 葡萄糖10.0 g·L-1，蛋白胨5.0 g·L-1，硝酸鉀 1.0 g·L-1，磷酸氫二鉀0.5 g·L-1，硫酸鎂 0.5 g·L-1，氯化鈉 0.5 g·L-1，硫酸亞鐵0.01 g·L-1，去離子水1 000 mL，pH值調至7.2，添加瓊脂粉15.0 ～20.0 g·L-1。

1.3.2 牛肉膏蛋白胨培養基（培養細菌） 牛肉膏5.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，氯化鈉5.0 g·L-1，去離子水1 000 mL，pH值調至7.2，添加瓊脂粉15 ～20 g·L-1。

1.3.3 牛肉膏蛋白胨液體培養基（培養細菌） 牛肉膏5.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，去離子水1 000 mL，pH值調至7.2。

1.3.4 馬鈴薯培養基 馬鈴薯200.0 g·L-1，葡萄糖20.0 g·L-1，瓊脂15.0 ～20.0 g·L-1，去離子水1 000 mL，pH值調至7.2。

1.4 試驗方法

1.4.1 微生物分離純化 在無菌條件下稱量1.0 g園林廢棄物腐熟材料樣品，裝入無菌三角瓶中，加入99 mL無菌水，密封后置于培養振蕩器（200 r·min-1、25 ℃）振蕩20 min，對混勻的樣品進行梯度稀釋，配制成1×10-2，1×10-3，……1×10-8不同濃度梯度的稀釋液。

微生物分離純化試驗在蘇州大學植物栽培與生理實驗室進行。使用移液槍吸取各濃度梯度的園林廢棄物稀釋液100 μL，在牛肉膏蛋白胨培養基和改良高氏1號培養基上均勻涂布，進行細菌以及真菌分離，每個濃度園林廢棄物稀釋液平行凃板3個。細菌于31 ℃培養24～48 h，觀察各梯度平板中菌落數量及分布情況，挑選出優勢菌落分布較均勻的平板，根據菌落形態特征各異分別挑取單菌落，劃線接種于新的牛肉膏蛋白胨培養基上，將純化2～3次后的菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在31 ℃ 200 r·min-1振蕩12～24 h；吸取0.7 mL菌液注入菌種保存管內，再加入0.7 mL已滅菌的80%甘油，搖晃使其混勻，置于-70 ℃冷凍保存。真菌平板于28 ℃倒置培養72 h，觀察各梯度平板中菌落數量及分布情況，篩出優勢菌落數量分布均勻的梯度平板，將不同形態特征的微生物菌落依次分離單接種到新的改良高氏1號培養基上純化2～3次，將分離幾次后的微生物菌株在28 ℃下培養3 d，后置于4 ℃冰箱保藏。

1.4.2 菌株鑒定 （1）細菌和真菌基因組DNA提取。取液體培養基內容物5 mL，12 000 r·min-1離心1 min，清除上清液；加入細胞懸浮液500 μL，置于37 ℃溫水浴中1 h，期間相隔幾分鐘混勻1次；12 000 r·min-1離心2 min，清除上清液；加入225 μL緩沖液A，使菌體與緩沖液混合均勻；再加入10 μL蛋白酶K，振蕩使其混勻；加入裂解緩沖液S 25 μL，振蕩使其混勻；57 ℃水浴放置20 min，其間顛倒混勻1～2次；加入緩沖液B 250 μL，顛倒混勻；加入乙醇250 μL，混勻，瞬時離心以去除管蓋內壁的水珠；把離心管中所有物質加入吸附柱內，12 000 r·min-1離心30 s，倒棄廢液，將吸附柱放入收集管中；取緩沖液 C 500 μL添加到吸附柱內，12 000 r·min-1離心30 s，倒棄廢液，將吸附柱放入收集管中；將700 μL漂洗液W2添加到吸附柱內，12 000 r·min-1離心30 s，倒棄廢液，將吸附柱放入收集管中；將500 μL漂洗液W2添加到吸附柱內，12 000 r·min-1離心30 s，倒棄廢液，將吸附柱放入收集管中；將吸附柱放回收集管中；12 000 r·min-1離心2 min；將吸附柱置于一個新的1.5 mL離心管中，去除殘存的漂洗液；將吸附柱放回收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100～200 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r·min-1離心2 min，將溶液收集到離心管中；所提取DNA稀釋20倍作為PCR模板，剩余菌液加入等體積甘油放-80 ℃保存。

（2）細菌16S rDNA及真菌rDNA ITS基因克隆。PCR反應體系：9.5 μL焦碳酸二乙酯水，上下游引物各1 μL，1 μL模板DNA，Taqmix 12.5 μL。

PCR的反應條件：在98 ℃條件下預變性3 min，然后98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min；在4 ℃條件下保存。

細菌16S rDNA基因克隆選用引物對：27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；真菌rDNA ITS基因克隆選用引物對：ITS1 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

（3）細菌16S rDNA及真菌rDNA ITS序列分析。 在PCR結束后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將含有預期片段大小的PCR產物送到蘇州木芮生物科技有限公司檢測。用Contig Express軟件對雙向測序完成的產物序列進行拼接，通過 NCBI數據庫的BLAST工具進行在線檢索，對序列進行同源性分析，通過其相似度和覆蓋度進行真菌和細菌的種屬鑒定。

2 結果與分析

2.1 優勢菌落的分離

通過對不同稀釋梯度平板中的微生物菌落進行觀察，結果發現，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5的園林廢棄物稀釋液平板中微生物菌落數量多且分布雜亂，菌落交叉生長，難以區分單菌落；1×10-6，1×10-7，1×10-8的稀釋液平板中微生物數量及種類分布較為均勻，菌落獨立不重疊，且所出現的菌落種類在各梯度均有生長。因此，真菌和細菌的分離從1×10-6，1×10-7，1×10-8的稀釋液平板中挑選進行涂板培養。

取馬鈴薯葡萄糖培養基平板10個，每個平板十字型劃分為4塊，分別編號Z1-20，X1-20。按照濃度梯度，從1×10-6，1×10-7，1×10-8的菌落平板中選取適宜菌落，用接種環蘸取菌落劃于馬鈴薯培養基對應標記區域，將培養出的菌株用于后續細菌和真菌菌株的DNA序列分析。

2.2 細菌菌株DNA序列分析

2.2.1 細菌菌株16S rDNA序列克隆 從圖1可以看出，在預期的1 500 bp附近檢測出陽性條帶，說明大部分細菌16S rDNA序列克隆成功。2.2.2 細菌菌株DNA序列比對結果及種類分布 通過對細菌序列進行拼接后利用BLAST在線比對其同源性，結果如表1和表2所示，分離獲得測序正確21個樣品，其相似性均≥97%，覆蓋率均≥98%，鑒定出3門5綱7目10科13種細菌。其中，厚壁菌門（Firmicutes）共鑒定出4種細菌，分屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）和解硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus），分別鑒定出1種和3種細菌；變形菌門（Proteobacteria）共鑒定出6種細菌，分屬于短波單胞菌屬（Brevundimonas）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、草螺菌屬（Herbaspirillum）、近伯克氏菌屬（Paraburkholderia）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、沙雷氏菌屬（Serratia）；放線菌門（Actinobacteria）鑒定出3種細菌，分屬于谷氨酸菌屬（Glutamicibacter）、微桿菌屬（Microbacterium）、原小單孢菌屬（Promicromonospora）。21個樣品中，米氏硫胺素芽孢桿菌（A.migulanus）最多，有4個，其次草螺菌（H. sp.）和嗜麥芽寡養單胞菌（S. maltophilia）分別有3個，解硫胺素芽孢桿菌（Aneurinibacillus sp.）有2個，其他種均只有1個。

2.3 真菌菌株DNA序列分析

2.3.1 真菌菌株rDNA ITS序列克隆 由圖2可知，在預期的750 bp附近能檢測出陽性條帶，說明真菌rDNA ITS 序列克隆成功。

2.3.2 真菌菌株rDNA ITS序列比對結果及真菌種類分布 真菌rDNA ITS 測序及比對結果通過對真菌序列進行拼接后利用 BLAST 在線比對其同源性，結果如表3和表4，共測序正確9個樣本，其相似性和覆蓋率均為100%，鑒定出1門（子囊菌門）2綱2科3屬5種真菌。其中，青霉菌屬（Penicillium）中有3種，曲霉屬（Aspergillus）和短梗霉屬（Aureobasidium）各1種。9個樣本中，青霉菌（P. sp.）和出芽短梗霉（A. pullulans）出現的樣本數最多，分別有3個，產黃青霉（A. fumigatus）、桔青霉菌（P. citrinum）和薩氏曲霉（A. sydowii）均只有1個樣本。

3 結論與討論

園林廢棄物中有大量纖維素的存在，自然條件下纖維素中通過締合氫鍵形成致密結構，其外包裹纖維素和半纖維素，很難降解[1]。利用園林廢棄物堆制有機肥的過程中，堆肥微生物主要有細菌群落和真菌群落，菌株群落利用園林廢棄物中的有機物質代謝，加快堆制有機肥腐熟的進程[5]。園林廢棄物堆肥材料中，細菌是數量最大、分布最廣的微生物類群，不僅能夠快速利用水溶性單糖類物質，還具有分解木質纖維素的能力，因此，其生物活性在堆腐過程至關重要[6]。芽孢桿菌屬細菌是常見的優勢細菌[7]，本研究中也從園林廢棄物堆肥材料中分離和鑒定出1種芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌和3種解硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus）細菌，芽孢桿菌的生長適溫為50～70 ℃，堆肥高溫階段大量芽孢桿菌可增強對某些難降解有機物的分解，提高堆肥效率[8]。本試驗還分離和鑒定出3種放線菌門（Actinobacteria）細菌，堆肥過程中放線菌具有溶解木質素，分解纖維素的能力[5]，其中，原小單孢菌（P. thailandica）也是堆肥體系中的優勢菌群。本試驗中通過真菌 rDNA ITS 測序分析發現，9 株真菌分屬于2綱2目2科3屬5種。其中，青霉屬（Penicillium）的真菌最多，堆體內有機物以木質素、纖維素為主，該屬可以分泌大量纖維素酶來有效分解纖維素進行利用，其他屬的真菌也均有一定的抗逆及纖維素降解能力，如曲霉屬（Aspergillus）[1]，該屬的菌絲能夠散布在園林廢棄物堆肥材料內，通過分泌胞外酶來降解纖維素等有機物[11]。

本試驗僅從園林廢棄物堆肥材料中初步分離和鑒定出了部分堆肥體系細菌和真菌種類，而不同菌株特性及其降解纖維素和木質素能力大小，還有待進一步研究。

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