siRNA降低MACC 1基因表達對子宮內膜癌細胞增殖凋亡及PI 3K/AKT信號通路的影響研究

周斌,孫博,呂會娟,艾亮,古雅麗

鄭州市婦幼保健院1產科,2檢驗科,病理科3,鄭州4500000

子宮內膜癌是常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一,近些年的發病率呈上升趨勢,嚴重威脅女性的健康和生命.目前雖然子宮內膜癌的病因及發病機制尚不明了,但普遍認為是多基因多步驟控制的復雜過程,由于細胞增殖與凋亡比例失衡,導致子宮內膜上皮細胞惡性轉化[1].因此,探索引起子宮內膜癌發生發展的分子機制及與腫瘤細胞增殖凋亡有關的特異性蛋白分子,對于該病的診斷及治療具有重要意義.結腸癌轉移相關因子1(metastasis associated in colon cancer 1,MACC1)是肝細胞生長因子/肝細胞生長因子受體(HGF/c-MET)信號轉導通路中的一個關鍵調節因子[2],在結腸癌的侵襲轉移中有重要作用.隨后有多項研究證實MACC1與胃癌、宮頸癌、膠質瘤的發生相關[3-5].MACC1對子宮內膜癌細胞增殖凋亡的作用還未清楚.有研究發現MACC1在子宮內膜癌中表達上調,與其發生、病理分期、組織分化程度、侵襲等相關[6].鑒于此,本研究通過RNA干擾技術沉默子宮內膜癌中MACC1基因的表達,觀察細胞增殖及凋亡的變化,并進一步研究相關的分子機制.

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑和儀器

人子宮內膜癌細胞株Ishikawa購自ATCC細胞庫,胎牛血清、RPMI1640培養基均購自美國Hycloneo公司,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒購自Thermo公司;CCK8試劑盒購自上海生工有限公司,膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙錠(PI)細胞凋亡試劑盒購自華阜康生物科技股份有限公司,MACC1、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,cleaved caspase 3)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸激酶(phosphorylated serine/threonine kinase,p-AKT)抗體均購自美國abcam公司,酶標儀購自美國Bio Tek公司,流式細胞儀購自美國Bio-Rad公司.

1.2 細胞培養

Ishikawa細胞在含有10%胎牛血清及青鏈霉素雙抗的RPMI1640培養基中常規培養,當細胞在培養瓶中的生長融合度約80%時,用0.25%的胰蛋白酶消化傳代.傳2代以上即可用于實驗研究.

1.3 實驗分組及細胞轉染

Ishikawa細胞分為空白對照組(未轉染的細胞)、陰性對照組(轉染合成的陰性對照siRNA)和MACC1轉染組(轉染合成的MACC1-siRNA).取對數生長期的Ishikawa細胞,以2X105/孔的密度接種于6孔細胞培養板中培養24 h,細胞達到85%生長融合度時進行轉染,轉染步驟以LipofectamineTM2000說明書為標準.

1.4 CCK 8法檢測細胞增殖

取對數生長期的各處理組細胞,接種于96孔細胞培養板中,每孔含細胞5X103個,每孔中加200 μl.分別在培養24、48、72 h時終止培養.每孔加入CCK8試劑10 μl,37℃繼續培養2 h,振蕩5 min后,全自動酶標儀于490 nm波長處檢測各孔細胞的光密度(optical density,OD)值.每組均設置5個復孔,實驗重復3次.

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

依據Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒說明書進行操作.取對數生長期的細胞,按照1.3分組進行轉染,轉染48 h后收集細胞,磷酸鹽緩沖液潤洗后制備成1X106/ml的單細胞懸液,流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況.

1.6 Western blot法檢測蛋白表達

收集轉染48 h的各組細胞,經10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離,電轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,5%的脫脂奶粉于室溫下封閉1.5 h,分別加入 MACC1、PCNA、cleaved caspase 3、PI3K、p-AKT、GAPDH(均按照1∶1000稀釋)一抗,4℃孵育過夜后加入二抗,室溫孵育1.5 h,增強型化學發光法(enhanced chemiluminecence,ECL)進行顯色.以GAPDH作為內參,Quantity軟件分析蛋白條帶的灰度值,計算各蛋白的相對表達量.

1.7 統計學方法

采用SPSS 21-.0軟件進行數據分析,計量資料以均數±標準差()表示,多組比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗.以P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 轉染效率檢測

MACC1-siRNA轉染Ishikawa細胞48 h后,Western blot法檢測各組細胞中MACC1的蛋白表達,結果顯示,陰性對照組與空白對照組的MACC1蛋白相對表達量比較,差異無統計學意義(P>0.05);MACC1轉染組的MACC1蛋白相對表達量低于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05).(圖1、表1)

2.2 MACC 1-siRNA轉染對Ishikawa細胞增殖的影響

MACC1-siRNA轉染Ishikawa細胞24、48、72 h后,CCK8檢測各組細胞的增殖情況,結果顯示,轉染24 h時3組細胞OD490值比較,差異無統計學意義(P>0.05);轉染48 h和72 h時,MACC1轉染組細胞OD490值均低于空白對照組,差異均有統計學意義(P<0.05).(表2)

表1 3組細胞中MACC 1蛋白相對表達量的比較(±s)

表1 3組細胞中MACC 1蛋白相對表達量的比較(±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

0.577±0.056 0.568±0.051 0.172±0.021*77.919 0.000空白對照組陰性對照組MACC1轉染組F值P值MACC1蛋白相對表達量組別

表2 3組Ishikawa細胞OD490值的比較(±s)

表2 3組Ishikawa細胞OD490值的比較(±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

OD490值48 h 0.423±0.031 0.417±0.029 0.301±0.026*17.177 0.003 0.215±0.005 0.213±0.005 0.211±0.004 0.545 0.606 0.626±0.045 0.604±0.041 0.418±0.034*24.170 0.001空白對照組陰性對照組MACC1轉染組F值P值24 h 72 h組別

2.3 MACC 1-siRNA轉染對Ishikawa細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示,MACC1轉染組細胞凋亡率高于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05).(圖2、表3)±s)

表3 3組Ishikawa細胞凋亡率的比較(x-

2.4 MACC 1-siRNA轉染對Ishikawa細胞增殖凋亡相關蛋白及PI 3K/AKT信號通路蛋白表達的影響

Western blot法檢測增殖相關蛋白PCNA、凋亡相關蛋白cleaved caspase 3,PI3K/AKT信號通路蛋白PI3K、p-AKT的蛋白表達情況,結果顯示,MACC1轉染組PCNA、PI3K、p-AKT蛋白相對表達量均低于空白對照組,cleaved caspase 3蛋白相對表達量高于空白對照組,差異均有統計學意義(P<0.05).(圖3、表4)

表4 3組Ishikawa細胞PCNA、cleavedcaspa se 3、PI 3 K、p-AKT蛋白相對表達量的比較(±s)

表4 3組Ishikawa細胞PCNA、cleavedcaspa se 3、PI 3 K、p-AKT蛋白相對表達量的比較(±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

組別空白對照組陰性對照組MACC1轉染組F值P值0.665±0.053 0.642±0.051 0.152±0.023*127.243 0.000 0.117±0.015 0.110±0.012 0.263±0.026*64.269 0.000 0.482±0.047 0.465±0.042 0.144±0.018*75.951 0.000 0.106±0.012 0.113±0.013 0.022±0.008*61.218 0.000 PCNA cleaved caspase 3PI3K p-AKT

3 討論

子宮內膜癌病死率居婦科惡性腫瘤第3位,僅次于卵巢癌和宮頸癌,其發病機制較復雜,目前還未研究清楚,但越來越多的研究顯示子宮內膜癌的發生發展是一個與癌基因激活、抑癌基因失活有關的多基因多步驟的復雜過程[7].HGF/c-MET信號通路在多種惡性腫瘤的發展和進程中發揮重要作用,參與包括細胞增殖、凋亡、分化等多種生命活動過程[8].MACC1基因已被證實是HGF/c-MET信號通路的關鍵調節因子,最早是在結腸癌中被發現,可與c-MET啟動子結合,促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、血管生長等過程[9].有研究顯示,在肺癌、卵巢癌、膽囊癌等多種腫瘤中發現MACC1的存在,與細胞的生長、侵襲、轉移、凋亡等生物學特性及預后密切相關,卵巢癌中抑制MACC1的表達可明顯抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力,并可誘導細胞的凋亡[10];非小細胞肺癌中抑制MACC1的表達可抑制腫瘤細胞的增殖和促進凋亡[11];膽囊癌中下調MACC1的表達可降低腫瘤細胞的增殖和侵襲能力[12].本研究結果顯示,子宮內膜癌細胞中轉染MACC1-siRNA,細胞的增殖能力降低,凋亡增加.這提示MACC1在子宮內膜癌的發生發展中發揮重要作用.

細胞的增殖失控與凋亡失衡是引起腫瘤發生的重要原因,受到多種基因的調控.PCNA只在正常增殖細胞及腫瘤細胞內存在,與細胞的DNA合成有密切聯系,是細胞異常增殖的關鍵蛋白,目前已在子宮內膜癌、胃癌等多種腫瘤中檢測到高表達[13-14].細胞凋亡存在多條通路參與發生,其中caspase途徑在細胞凋亡過程中有重要作用,caspase 3作為caspase級聯反應下游最主要的蛋白酶,在細胞凋亡調節中起主導作用,被稱為"死亡執行蛋白酶",其被活化后可使凋亡進入不可逆階段.目前已應用于多種腫瘤凋亡的檢測指標[15-16].PI3K/AKT信號通路是細胞內一個重要的信號轉導通路,參與包括子宮內膜癌等多種腫瘤的發生發展[17].有研究顯示,子宮內膜癌中PI3K/AKT信號通路處于激活狀態,可促進腫瘤的發生發展,而抑制該信號通路后反之[18].PI3K下游有多種效應分子,AKT是PI3K/AKT信號通路下游直接底物,AKT磷酸化后,可增加腫瘤細胞的運動能力,參與細胞的增殖及凋亡過程,可抑制細胞凋亡而發揮抗凋亡作用.為了研究RNA干擾MACC1表達后引起細胞增殖凋亡的機制,本研究通過Western blot法檢測PCNA、cleaved caspase 3、PI3K、p-AKT的蛋白表達,發現抑制MACC1表達后PCNA、PI3K、p-AKT蛋白均下調表達,cleaved caspase 3蛋白上調表達.這提示抑制MACC1表達可通過調節PCNA、cleaved caspase 3、PI3K、p-AKT蛋白表達影響子宮內膜癌細胞的增殖凋亡.

綜上所述,抑制MACC1基因表達可降低子宮內膜癌細胞增殖,誘導細胞凋亡,上調cleaved caspase 3蛋白表達,下調PCNA及PI3K/AKT信號通路蛋白表達.這提示MACC1可能是臨床上子宮內膜癌分子診斷及靶向治療的靶點.后續研究中將檢測MACC1在子宮內膜癌中的其他生物學特性,及從體內研究進行深入研究.