醋炙對元胡水煎液物理化學性質及抑制腫瘤細胞活性的影響△

王征，唐志書，梁艷妮，任浪浪，程靜，宋忠興

(陜西中醫藥大學 陜西省中藥資源產業化協同創新中心/陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室/陜西省風濕與腫瘤類中藥制劑工程技術研究中心，陜西 咸陽 712046)

中藥是一個復雜體系，一種中藥中常含有多種結構、性質不盡相同的化學成分，這也是中藥多靶點多效應的物質基礎[1]。中藥在炮制、煎煮的過程中，各種化學成分之間發生著復雜多變的各類物理、化學變化，從而使這一原本復雜的體系更加復雜。長期以來，學界往往以中藥的某類或某幾個化學成分作為中藥質控的標準，而忽視了反映中藥作為一個整體的物理化學性質的變化[2]。課題組經過長期研究發現，不同炮制方法、不同溶劑提取的中藥，其自身物理化學性質存在很大區別[3-4]。中藥自身的物理化學性質是中藥中不同化學成分及結構組成的外在表現，具有便于檢測、性質穩定、可重復性好等優點，與中藥質量及其藥效學具有密切的聯系[5]。故此，探索中藥自身的物理化學參數與中藥質量和藥效學之間的關系，建立中藥-物理化學性質-藥效學研究模式，對于將中藥作為一個整體，解決中藥質量控制和藥效學物質基礎都具有廣泛的指導意義。

元胡又名延胡索，為罌粟科植物CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖。具有活血、行氣、止痛的功效，主要用于氣血瘀滯諸痛癥[6]。歷代對元胡的炮制有生用、炒、醋炙、酒炙、鹽炙等[7]。2015版《中華人民共和國藥典》載有生元胡和醋元胡。現代植物化學研究表明，元胡主要活性成分為異喹啉生物堿類，主要有原小檗堿型，原阿托品堿型，阿樸菲型，苯并菲啶型等[8-10]。藥理學顯示元胡除了具有非常好的鎮痛作用外，對心血管系統疾病和腫瘤都具有良好的治療作用[11]。目前關于元胡的化學物質基礎和藥理作用研究較多，但關于其物理化學性質及其與藥效作用之間的關系尚未見研究報道。故，課題組在前期研究的基礎上，研究了元胡醋炙前后水提液物理化學性質的變化，并將其與兩者的抗腫瘤細胞活性聯系起來，對于探索建立中藥-物理化學性質-藥效學研究模式提供實驗基礎。

1 材料

1.1 實驗儀器

TGL-20B離心機(上海安亭科學儀器廠)、HH-S4型數顯恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)、ZDHW調溫電熱套(北京中興偉業儀器有限公司)、黏度計(美國BROOKFIELY 博力飛))、VaCo型低溫冷凍干燥儀(Zirbus technology)、PHSJ-4F實驗室PH計(儀電科學儀器)、DDS-307電導率儀(上海精科)、激光粒度分析儀(Malvern 3000)、CO2恒溫培養箱(Sanyo公司)、Thermo 熱點Multiskan FC酶標儀(美國Thermo公司)、高溫滅菌鍋、96孔細胞培養板、TS100-F顯微鏡(Nikon公司)、超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)。

1.2 實驗細胞株

人肝癌細胞株HepG2、人肺癌細胞株A549均購自西安運達生物科技有限公司。

1.3 藥品與試劑

元胡中藥材，經陜西中醫藥大學生藥教研室主任王繼濤高級實驗師鑒定為罌粟科植物CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖(陜西興盛德藥業有限責任公司，批號：20170101)；醋元胡中藥材，經陜西中醫藥大學生藥教研室主任王繼濤高級實驗師鑒定為罌粟科植物CorydalisyanhusuoW.T.Wang的醋制干燥塊莖(陜西興盛德藥業有限責任公司，批號：20170101)；蒸餾水(HyClone改良型RPMI-1640)；培養液(賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司)；胎牛血清(美國Biological Industries 公司，批號：1552680)；MTT；磷酸緩沖液；0.25%胰蛋白酶(Solarbio公司，批號：20170315)；無菌水；去離子水；DMSO。

2 實驗方法

2.1 元胡與醋元胡水煎液的制備

稱取元胡20.0 g，加10倍量的水即200 mL，浸泡30 min，煮沸后保持微沸1 h，濾過，取濾液備用。藥渣加8倍量的水，再煎煮1 h，濾過，取濾液。兩次濾液合并，濃縮并定容至100 mL，5000 r·min-1離心15 min，備用。

醋元胡水煎液的制備同上。

為避免實驗誤差，上述同一批號的藥材重復三次實驗操作，所得藥液分別進行以下物理化學參數測定。

2.2 物理化學參數的測定

取上述制備的元胡和醋元胡水提液，均通過恒溫槽控制在25 ℃，采用馬爾文粒度儀測定水提液的粒徑和Zeta電位，pH 計精密測定pH，電導率儀測定電導率，旋轉式黏度計測定黏度。上述每組供試液重復測定三次。

將上述數據測定完成之后，將三次元胡的水煎液和醋元胡的水煎液分開合并，置于水浴鍋上蒸發至浸膏狀，-80 ℃冷凍24 h，然后置于冷凍干燥器中干燥24 h，取出，研成細粉，備用。

2.3 細胞培養

將HepG2和A549細胞分別消化于含有10% 胎牛血清的RPMI-1640培養液(pH 7.0～7.4)中，在恒溫培養箱中37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進行傳代培養。

2.4 受試藥液的制備

精密稱量元胡及醋元胡凍干粉50 mg，用空白培養液配成10 mg·mL-1母液，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。將母液分別稀釋4倍，10倍，即2.5 mg·mL-1、1 mg·mL-1，再將1 mg·mL-1稀釋4倍，即0.25 mg·mL-1，置于4 ℃保存，備用。

2.5 MTT試驗

分別取對數生長期的細胞株，調整細胞密度為每升5×107，接種于每孔200 μL RPMI-1640培養基的96孔板上，置于恒溫培養箱中37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養24 h，待細胞貼壁后更換新鮮培養液，每孔200 μL。實驗組加入不同濃度(10、2.5、1、0.25 mg·mL-1)藥品溶液，每孔終濃度分別為0、10、20、50、100、200、400、800、1200 μg·mL-1；同時設置對照組和調零孔，每個處理組設置3個平行孔。加藥完畢后96孔板置于恒溫培養箱中培養48 h后，換新鮮培養液(每孔180 μL)，每孔加入新鮮配制的MTT溶液(5 g·L-1)20 μL，繼續在恒溫培養箱中培養4 h。吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，每分鐘60次，震蕩10 min后，用酶聯免疫標定儀測定490 nm 處吸光度(A)值，計算藥液對腫瘤細胞生長增殖的抑制率。

2.6 統計學處理

3 結果與討論

3.1 物理化學參數測定結果

對元胡和醋元胡水煎液各項物理化學參數測定結果如下表1所示。

表1 元胡與醋元胡水煎液物理化學參數測定結果

注：**表示醋元胡水煎液各參數與元胡水煎液各參數對比，P<0.01。

可以看出元胡水煎液的粒度、黏度、電導率小于醋元胡水煎液，而Zeta電位和pH大于醋元胡水煎液。為了更直觀的看到這種變化規律，將這五種物理化學參數變化做成柱形圖，如下圖1：

從圖中可以看出，醋炙后水煎液的粒度、黏度、電導率增加，而Zeta電位和pH都有所下降。其中粒度、黏度和電導率變化顯著，Zeta電位和pH雖有變化，但不具備顯著性。

注：A.元胡與醋元胡水煎液粒度、黏度、電導率、Zeta電位和pH變化圖；B.A圖單位過大，將電導率、Zeta電位和pH單獨作圖。圖1 元胡與醋元胡水煎液物理化學參數

研究表明，生物堿是元胡的主要活性成分。許翔鴻等[12]從元胡中分離得到13個生物堿單體，其中12個結構明確，分別是d-紫堇堿、四氫巴馬亭(延胡索乙素，THP)、去氫紫堇堿、巴馬汀、四氫黃連堿、四氫小檗堿、異紫堇球堿、原托品堿、四氫非洲防己胺、Saulatine、海罌粟堿、脫氫海罌粟堿。張曉麗等[13]從元胡中分離得到紫堇明、氧海罌粟堿(oxoglaucine)、降氧化北美黃連次堿、山崳酸、β谷甾醇、胡蘿卜苷、香草酸、對羥基苯甲酸；Chen等[14]從元胡中分離得到13-甲基-巴馬土賓及13-甲基-去氫紫堇薩明堿。

從上述研究可以看出，元胡中含有大量生物堿，且具有廣泛的藥理作用。另有研究表明，元胡經醋炙后其中的生物堿成分溶出明顯增多[15-16]。生物堿為含N的一類次生代謝產物，經醋炙后形成醋酸鹽而使其在水中的溶解性增加，從而溶出度增大。2015版《中華人民共和國藥典》規定，醋炙時“加醋拌勻，悶透，置炒制容器內，炒至規定溫度，取出，放涼。”[17]由此可以看出，醋炙后多余的醋酸基本揮發干凈，而與元胡生物堿成鹽中和的醋酸已不顯酸性。由上述張曉麗的研究結果可以發現，元胡中還含有香草酸、山崳酸及對羥基苯甲酸等酸性成分，故水煎液成酸性。醋炙前后pH變化不明顯。

電導率可以反應出溶液中離子濃度的多少，醋炙后生物堿成鹽，溶液中離子濃度也同時增加，故醋炙后水提液的電導率增加。Zeta電位是溶液體系穩定性的指標。如果顆粒帶有很多負或正的電荷，即就是Zeta電位很高，其相互排斥，從而使整個體系趨于穩定。相反，如果顆粒帶有很少負或正電荷，即Zeta電位較低，顆粒之間即會相互吸引，從而使整個體系不穩定。醋炙后，帶負電荷的生物堿被醋酸的質子中和，水提液中生物堿濃度雖然增加，但其為中性的生物堿醋酸鹽，故負電荷降低，Zeta電位同時降低，但不具有顯著性。Zeta電位的降低引起了粒子之間的相互吸引，故整個體系的粒度增加，黏度同時也增加，且具有顯著性差異。

3.2 醋炙對元胡提取液抗腫瘤細胞活性影響

用MTT法分別檢測元胡和醋元胡水提液凍干粉在0～1200 μg·mL-1濃度范圍內HepG2和A549細胞體外生長增殖的影響，所得實驗數據處理后如下表1所示。

表2 元胡和醋元胡不同濃度提取液對HepG2和A549細胞的抑制率

從上表2可以看出，元胡和醋元胡水提液凍干粉在所選濃度范圍內都對兩種腫瘤細胞株有一定的抑制作用，且隨著濃度的增大，抑制率也隨之增大。為了更加直觀看出這種變化，以抑制率對濃度作圖，結果如下圖2所示：

注：A.元胡和醋元胡不同濃度提取液對HepG2的抑制作用；B.元胡和醋元胡不同濃度提取液對A549的抑制作用。圖2 元胡和醋元胡不同濃度提取液對HepG2和A549細胞的抑制作用

從上圖可以看出，元胡和醋元胡水提液凍干粉對HepG2和A549細胞的生長增殖都有一定的抑制作用，且抑制率隨濃度的增加而增大。在所選濃度范圍內，元胡水提液凍干粉對兩種腫瘤細胞生長增殖的抑制作用弱于醋元胡水提液凍干粉。元胡中的主要活性成分為生物堿類，而醋炙的過程會使元胡中生物堿成分溶出增加，故其活性強于生品，這也是元胡炮制的主要原因。

4 討論

中藥水提液既是數千年中醫藥傳統用藥習性的沿襲，又是中藥制藥工藝過程中最基本的中間產物。從物理化學角度出發，中藥水提液可被視為一種由混懸液、乳濁液與真溶液共組而成的十分復雜的混合分散體系。中藥水提液的宏觀性質，可用其各種物理化學表征參數描述，而這類物理化學表征參數，既來源于中藥水提液中各種物質的化學組成，又是水提液體系中各種物質不同表現的綜合反饋[18]。

元胡具有行氣、活血、止痛的功效，臨床常用其醋炙品。現代藥理研究表明，元胡主要活性成分為異喹啉生物堿類，且具有良好的抗腫瘤作用。本文著重研究中藥元胡在醋炙前后水提液物理化學性質的變化及對其腫瘤細細胞活性的影響。從實驗結果可以得出，醋炙后隨著生物堿溶出的增加，水提液的Zeta電位和pH有所降低，但不顯著，而粒度、黏度和電導率則顯著增加。這些參數的變化與醋炙過程中生物堿與醋酸反應形成醋酸鹽而增溶密切相關。MTT實驗結果表明，醋炙后的元胡水提液凍干粉對HepG2和A549細胞的抑制作用強于元胡水提液凍干粉。

中藥水提液的物理化學性質與其所含化學成分密切相關，而這些化學成分又是中藥得以發揮藥效作用的物質基礎[18]。因而，本文將元胡和醋炙元胡水提液的物理化學性質與其抗腫瘤活性進行關聯研究，在揭示元胡醋炙對其水提液物理化學參數及抗腫瘤細胞活性影響的同時，也是對建立中藥-物理化學參數-藥效學研究模式的一次探索。而這一切變化都源于醋炙后中藥自身化學成分的變化。中藥是一個復雜的體系，含有多種化學成分，當前尚無任何一味中藥的化學成分被完全研究清楚。古人將中藥作為一個整體，提出了其性、味、歸經以指導臨床用藥。中藥藥性作為遣方用藥最基本的理論，與中藥的功效密切相關。在中醫藥現代化的今天，中藥藥性的研究仍然是中藥學研究的重點領域。將液體物理化學參數的概念引入到中藥水煎液研究當中，借助現代科學可量化的參數，表征傳統藥液的性質。每味中藥所含化學成分不同，因此其水煎液所具有的物理化學參數必然不同。同時，每味中藥也有著自己獨特的藥效，而這些藥效往往通過所含化學成分來發揮作用。因此，構建中藥-物理化學參數-藥效學之間的關系，從新的視角去審視中藥，借助現代溶液性質研究中藥的物理化學參數，另避蹊徑，探尋中藥自身的變化規律，對解決中藥質量控制和藥效學物質基礎都具有重要的指導意義。