多指標綜合評分法結合Box-Behnken響應面法優選心痛寧膠囊醇提工藝△

劉怡，如扎·哈布都拉，李露，王萍，2，孟瑤，李玉婷，依孜提·帕力哈提，張麗娟，聶繼紅，2*

(1.新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學第四臨床醫學院，新疆 烏魯木齊 830000)

心痛寧膠囊是國醫大師新疆醫科大學第四臨床醫學院沈寶藩教授三十多年來治療心血管疾病的臨床經驗方，處方由川芎、當歸、厚樸等多味藥材組成，對治療痰瘀互結型冠心病療效顯著。方中含有川芎、當歸、厚樸等多味藥材，具有擴張血管，抗血小板聚集等多重藥理作用[1-5]。原方以傳統湯劑方式服用，將其開發成膠囊劑則可以克服湯劑服用劑量大、口感差、儲存攜帶不便等不足，最大程度地方便患者。

Box-Behnken響應面法是采用多元二次方程來擬合因素和效應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最佳工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法[6]。本課題通過多指標綜合評分，運用Box-Behnken響應面法優選心痛寧膠囊醇提工藝，為該課題的后續研究開發奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Waters-2695)；紫外可見分光光度計(Cintra 20)；SI-234電子天平[丹佛儀器(北京)有限公司]；AGL-135電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海有限公司)]；SK250LHC超聲清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

阿魏酸對照品(批號：110773-201012)、厚樸酚對照品(批號：110729-200310)和厚樸酚對照品(批號：0730-200206)、蘆丁對照品(批號：100080-200707)(中國食品藥品檢定研究院)；冰醋酸為分析純；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水。

川芎、當歸、厚樸等藥材飲片均購自于亳州市中正藥材飲片有限公司，由新疆醫科大學第四臨床醫學院藥學部提供，經李永和主任中藥師鑒定，結果均符合2015版《中華人民共和國藥典》一部各項有關規定。

2 方法與結果

2.1 阿魏酸、厚樸酚以及和厚樸酚的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性實驗 色譜柱Symmetry C18(150 mm4.6 mm，5m)；十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A和B分別為乙腈和1%冰醋酸溶液，按表1所示進行梯度洗脫。阿魏酸及厚樸酚類檢測波長分別為318、298 nm，體積流量為1.0 mL·min-1，進樣量為10L，柱溫為30 ℃[7-10]。

表1 梯度洗脫

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取適量阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚對照品，加色譜甲醇制成質量濃度分別為0.01、0.26、0.38 mg·mL-1的混合儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取處方中擬采用醇提的藥材，加60%乙醇10倍量，加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液，經紗布濾過，濾液離心60 min后取上清液10 mL，蒸干，干膏加適量色譜甲醇溶解，定容到5 mL容量瓶刻度，經0.45m的微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 稱取處方中除當歸、川芎、厚樸以外的中藥材，按2.1.3項下方法制備陰性樣品溶液。

2.1.5 線性范圍考察 精密吸取2.1.2項下混合儲備液1、2、3、4 mL用色譜甲醇定容于5 mL量瓶中，得到不同濃度的溶液，同時取混合儲備液，在2.1.1項色譜條件下測定。以峰面積為縱坐標(Y)，以濃度為橫坐標(X)進行線性回歸，得到回歸方程，結果見下表2。

表2 回歸方程和相關系數

2.1.6 精密度試驗 精密吸取2.1.2項下對照品溶液，按2.1.1項色譜條件進樣10 μL，連續進樣6次，測定得阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為1.70%、0.77%、0.23%，表明儀器的精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 按處方比例，稱取6份同一批醇提藥材，按2.1.3項下制備供試品溶液，在2.1.1項色譜條件下進樣10 μL，測定得阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為0.63%、1.06%、1.09%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，在2.1.1項色譜條件下分別于制備后的第0、6、8、12、24、48 h進行測定，進樣10 μL后得到阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為0.70%、1.13%、1.58%，結果表明，供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取已知含量的待測溶液6份，分別加入阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚對照品0.20、1.34、1.27 mg，按2.1.3項下制備供試品溶液，按2.1.1項的色譜條件進樣10 μL測定，結果平均加樣回收收率分別為95.46%、103.92%、103.13%，RSD分別為2.24%、2.82%、0.57%，結果表明本品的加樣回收率良好。

注：A.混合對照品溶液(318 nm)；B.混合對照品溶液(298 nm)；C.供試品溶液(318 nm)；D.供試品溶液(298 nm)；E.缺阿魏酸陰性樣品(318 nm)；F.缺厚樸酚及和厚樸酚陰性樣品(298 nm)；1.阿魏酸；2.和厚樸酚；3.厚樸酚。圖1 心痛寧膠囊中阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚的HPLC圖

2.2 總黃酮的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品適量，加無水乙醇充分溶解，作為對照品儲備液(質量濃度為2.001 mg·mL-1)。

2.2.2 供試品溶液的制備 按擬定的實驗方案進行提取，備用。

2.2.3 最大吸收波長的確定 精密移取適量2.2.1項蘆丁對照品，加入60%乙醇溶液6 mL，5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻靜置6 min后再加10%硝酸溶液1 mL，混勻靜置6 min，最后加入4.3%氫氧化鈉溶液10 mL，混勻靜置15 min后測定，以相同的方法制備空白液，在400～700 nm[11-13]范圍內掃描。結果對照品溶液和供試品溶液在500.8 nm處均有最大吸收，見圖2。

圖2 蘆丁對照品和樣品的紫外-可見光譜

2.2.4 標準曲線的制備 分別精密吸取2.2.1項下對照品儲備液0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 mL，在500.8 nm處測定上述方法顯色后的不同濃度儲備液的吸光度(A)值。以吸光度為縱坐標，以蘆丁濃度為橫坐標得到回歸方程：Y=1.418X-0.009 7(r=0.999 4)。表明蘆丁在0.3～1.1 mg范圍內的線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取0.5 mL蘆丁對照品溶液，在500.8 nm處連續測定6次上述方法顯色后吸光度，得到RSD值為0.50，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 按擬定的實驗方案平行制備6份供試品溶液，在500.8 nm處測定按2.2.1項顯色后的吸光度，得到RSD值為0.75%，表明該方法重復性較好。

2.2.7 穩定性試驗 精密移取0.5 mL按上述方法制備的供試品溶液，分別于制備后的第0、10、20、30、40、50、60 min測定按2.2.1項顯色后的吸光度，得到RSD值為1.97%，結果表明供試品溶液在1 h內穩定。

2.2.8 加樣回收率試驗 取2.2.1項下已知濃度的供試品溶液，取樣品與對照品含量為1∶1平行制備待測溶液6份，在2.2.1項下測定其吸光度，結果得到平均加樣回收率為97.76%，RSD=0.37%，結果表明本品的加樣回收率良好。

2.3 浸膏得率的測定

將50 mL供試液精密吸取于已干燥至恒重的蒸發皿中，蒸干后放入105 ℃烘箱內干燥3 h，在干燥器中冷卻后迅速精密稱定重量，計算其浸膏得率[14]。

(1)

2.4 單因素試驗

分別對提取次數、提取時間、加醇濃度、加醇倍量進行單因素試驗，根據單因素試驗的結果來確定Box-Behnken響應面試驗的因素水平范圍[15-17]。

2.4.1 提取時間初步考察 按擬定處方量稱取藥材，將加醇倍量固定為10倍，加醇濃度固定為60%，提取次數固定為1次，考察提取時間分別為30、60、90、120 min時的綜合評分，結果綜合評分在30～60 min時呈遞增趨勢，60～90 min時呈遞減趨勢，故最佳提取時間確定60 min。

2.4.2 加醇濃度初步考察 按擬定處方量稱取藥材，將加醇倍量固定為10倍，提取時間固定為1 h，提取次數固定為1次，考察加醇濃度分別為50%、60%、70%、80%時的綜合評分，結果綜合評分在50%～60%呈遞增趨勢，60%～70%呈降低趨勢，故最佳加醇濃度定為60%。

2.4.3 加醇倍量初步考察 按擬定處方量稱取藥材，將加醇濃度固定為60%，提取時間固定為1 h，提取次數固定為1次，考察加醇倍量分別為6倍、8倍、10倍、12倍時的綜合評分，結果綜合評分在8倍～10倍呈遞增趨勢，10倍～12倍呈下降趨勢，故最佳加醇倍量定為10倍。

2.4.4 提取次數的初步考察 按擬定處方量稱取藥材，將加醇倍量固定為10倍，加醇濃度固定為60%，提取時間固定為1 h，分別考察提取1、2、3次的綜合評分，最終綜合評分分別為59.16%、94.10%、96.45%，由于提取2次和提取3次的綜合評分結果差別不大，從工業化大生產節約成本的角度考慮，提取次數確定為2次。

2.5 Box-Behnken響應面法優化提取工藝

2.5.1 響應面試驗設計 在單因素試驗的基礎上，按擬定處方量稱取醇提藥材，根據綜合評價指標對醇提工藝的影響，確定綜合評分=阿魏酸×0.4+總厚樸酚×0.2+總黃酮×0.2+浸膏得率×0.2(總厚樸酚=厚樸酚×0.5+和厚樸酚×0.5)，提取次數固定為1次，以提取時間(X1)、加醇濃度(X2)、加醇倍量(X3)作為考察指標進行Box-Behnken響應面設計[18-19]，因素及水平見表3。

表3 Box-Behnken實驗設計的因素和水平

采用Design-Expert 軟件設計試驗方案，對加醇倍量、加醇濃度、提取時間進行研究[20-21]，結果見表4。

表4 Box-Behnken設計及結果

2.5.2 模型擬合 利用方差分析對各因素進行多元二次回歸，得到的回歸方程Y=90.46+11.92X1+2.81X2+3.77X3-3.55X1X2-2.99X2X3-1.71X1X3-13.41X12-7.29X22-8.04X32，由表5可知，X1、X2、X12、X22、X32具有顯著影響，其影響程度為X2>X1>X3；失逆項P>0.05，說明失擬不顯著，因此本回歸方程能較好地分析與預測本研究的醇提工藝。根據回歸分析結果繪制三維響應面圖，見圖3～4。

表5 回歸模型的方差分析

圖3 各因素對綜合評分的三維響應面圖

圖4 提取工藝對各因素之間的等高線圖

2.5.3 驗證試驗 通過對試驗結果的分析，最佳醇提工藝：加入60.53%的乙醇10.36倍，提取72 min。結合實際生產所需，將最佳醇提工藝確定為60%的乙醇10倍量，提取60 min。按照最佳醇提工藝，進行3次平行驗證試驗，其綜合評分分別為96.36、98.04、95.80，平均綜合評分為96.73(RSD為1.21%)，與預測值(93.41)相似，說明次二項式方程的適用性良好。優選的提取工藝合理，可行。

3 討論

參照2015年版《中華人民共和國藥典》及文獻方法測定阿魏酸及總厚樸酚含量時，考察了乙腈、甲醇、冰醋酸、磷酸等多種流動相體系，發現乙腈-冰醋酸體系對于阿魏酸及總厚樸酚體系峰型較好，保留時間適宜。考察冰醋酸時發現，1%冰醋酸使各色譜峰的分離度及峰型效果最好，為最優濃度，調整乙腈-1%冰醋酸溶液不同配比，最后選擇流動相(0～17 min，12%乙腈；17～18 min，12%～54%乙腈；18～35 min，54%乙腈)。

采用紫外分光光度法測定總黃酮時，在1 h內顯色結果穩定，超過1 h，供試品溶液則出現絡合物沉淀，所以應在1 h內完成顯色測定。

在研究初始階段，首先采用文獻研究法查閱相關文獻，最終確定了處方中各味藥材有效成分的理化性質及藥理作用，確定其中部分藥材使用醇提工藝，故采用多指標綜合評分結合Box-Behnken響應面設計的方法，以阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚、總黃酮的含量及浸膏得率作為綜合評價指標，通過一系列的實驗研究獲取了更加優化的心痛寧膠囊醇提工藝。此結果為工業化大生產奠定了研究基礎，為以后的科研創新提供了思路。