腫節風黑斑病拮抗真菌zjts7的抑菌作用測定與鑒定△

宋利沙，蔣妮，2*

(1.廣西壯族自治區藥用植物園，廣西 南寧 530023；2.廣西大學農學院，廣西 南寧 530004)

腫節風為金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.)的干燥全草，又名九節茶、接骨木等，主要分布于我國華南、華東、西南各省區，在朝鮮、日本、東南亞和印度也有分布[1]。其具有清熱涼血、活血消斑、祛風通絡等功效，用于治療血熱紫斑、紫癜，風濕痹痛，跌打損傷等癥，是中國藥典的收錄品種[2]，還是廣西重要的傳統瑤藥品種“七十二風”中重要的風藥品種之一[3]。現代藥理和毒理研究表明腫節風還具有抗菌消炎、抑制流感病毒、抗腫瘤和促進骨折愈合及鎮痛等多種活性，急性毒性試驗結果屬實際無毒，具有較好的安全性[4]。以腫節風為主要原料的制劑有草珊瑚含片、腫節風片、腫節風注射液、血康口服液等[5]。腫節風在廣西靖西、融安、東蘭等縣大面積種植過程中，發生了一種嚴重影響生長的葉部病害(黑斑病)，此病害是由半知菌類炭疽屬黑線炭疽菌Colletotrichumdematiu引起的[6]。經前期調查發現該病害平均發生率達50%以上，特別在融安的林下套種模式，發病率高達65%，嚴重影響了腫節風藥材的生長及發展[6]，因此對腫節風病害的研究和防治具有重要意義。

目前，腫節風黑斑病的防治以施用化學農藥為主，長期施用農藥病原菌易產生抗藥性和耐藥性，難以根治，且易給生態環境帶來農藥殘留等負面影響。利用生防菌防治植物病害，具有對環境安全的優點，已經成為防治植物病害的重要方法之一，是目前國內外研究熱點，也是綠色中藥材發展的必然趨勢。至今，利用生防菌防治農作物病害的已有較多報道，而用于防治腫節風黑斑病的生防菌篩選和應用尚未見報道，作者在前期工作中從健康腫節風根系土壤里初步分離篩選到一株對腫節風黑斑病菌具有抑菌作用的真菌zjts7，本研究進一步測試對腫節風的黑斑病菌的抑制作用，并通過形態學和分子生物學特征對該菌株進行鑒定，以期為腫節風黑斑病菌的生物防治提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原菌：腫節風黑斑病菌菌株由廣西藥用植物園植病研究室分離和保存。2017年4月在廣西壯族自治區藥用植物園科研基地采集自健康腫節風根系土壤，備用。

1.2 拮抗真菌的分離

采用平板稀釋法[7]進行健康腫節風根系土壤進行分離。

1.3 拮抗真菌zjts7抑菌作用測定

通過平板對峙[8]培養，在28 ℃下培養拮抗真菌和病原真菌5～7 d后，分別取直徑5 mm的菌絲塊接種于PDA培養基平板中，2個接種點在同一條中軸線上，且相距6 cm，以只接種病原真的平板為對照，重復3次。接種4 d后測其抑菌寬度，計算其抑菌率[9]。挑取拮抗真菌和病原真菌對峙培養相交處的菌絲，在光學顯微鏡下，觀察并記錄拮抗真菌zjts7對病原真菌菌絲形態的影響。

(1)

1.4 拮抗真菌zjts7的鑒定

1.3.1 形態鑒定 拮抗真菌zjts7在PDA平板上培養5～7 d，觀察在顯微鏡下的分生孢子、分生孢子梗及菌絲體等的形態特征，對其形態學鑒定。

1.3.2 ITS rDNA序列分析和比對 將培養3 d的拮抗菌株接種到40 mL PDA培養液的三角瓶(100 mL)中，于28 ℃、180 r·min-1，恒溫振蕩培養48 h后制成菌體懸浮液，離心收集菌體，采用改良的SDS裂解法用DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取真菌基因組DNA。ITS擴增引物序列為通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。擴增反應在25 μL反應體系中進行，Template(基因組DNA 20～50 ng·μL-1)為0.5 μL，10×Buffer(with Mg2+)為2.5 μL，dNTP(各2.5 mM)為1 μL，酶0.2 μL，引物各0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。熱循環反應程序設置如下：94 ℃下初始變性4 min，接下來為94 ℃下變性45 sec，55 ℃下引物退火45 sec，72 ℃下延伸60 sec，30個循環結束后在72 ℃下修復延伸10 min。擴增中利用雙蒸水代替DNA模板為空白對照。用凝膠電泳法檢測PCR反應結果，吸取4 μL PCR產物加入1%(W/V)瓊脂糖凝膠，凝膠置于1×TBE緩沖液(0.9 M Tris-Borate，0.01M EDTA，pH=8.3)中，在110 V下電泳40 min。將擴增后的 DNA 產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化測序。并且把測序結果與GenBank中的序列進行blast比對。以ITS相似序列，利用MEGA4.0軟件的Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 拮抗真菌zjts7的抑制作用

經平板對峙培養，結果表明，拮抗真菌zjts7菌株對腫節風黑斑病菌菌絲具有較明顯的抑制作用，抑制率可達到81.82%～100%(圖1)。試驗中觀察發現，此木霉菌生長速度快，很快占領整個生長空間，對峙4 d后將病原真菌包圍，抑制病原菌生長(圖1-A-B)。挑取拮抗真菌和病原真菌交界處的菌絲，在顯微鏡下觀察發現，腫節風黑斑病菌絲斷裂、畸形、膨大(圖2)。

注：A.四天后的黑斑病菌；B.對照；C.三天后的黑斑病菌；D.對照。圖1 zjts7菌株對腫節風黑斑病生長抑制效果

注：a.對照；b.黑斑病菌菌絲膨大、畸形、斷裂。圖2 zjts7菌株處理后腫節風病原菌菌絲形態

注：a.菌落；b.分生孢子。圖3 zjts7菌株形態

2.2 拮抗真菌zjts7的鑒定

2.2.1 形態鑒定 菌落初生長為白色，培養2 d后變綠，分生孢子濃密，均無色素和氣味，暗綠色，菌落背面是綠色(圖3-a)。分生孢子卵圓形或球形，大小為(3～5)μm×(2～4)μm(圖3-b)。主分支呈樹狀，分生孢子梗呈對生，且無延伸絲；頂端具有短的瓶梗，且基部細，中間膨大。此菌株的形態特征和已報道的棘孢木霉T.asperellum菌株相似[10-11]。

2.2.2 拮抗真菌zjts7的ITS rDNA序列分析 以ITS1、ITS4通用引物對zjts7菌株進行PCR擴增測序。結果獲得579 bp的rDNA-ITS基因序列，以blast程序將菌株的序列與GenBank中核酸序列進行相似性分析，此菌株rDNA-ITS基因序列與多個棘孢木霉T.asperellum的序列同源性最高，并構建其系統發育樹，菌株zjts7與棘孢木霉T.asperellum在同一分支，相似性達到100%。

根據菌株zjts7ITS rDNA序列分析，結合形態特征，將其鑒定為棘孢木霉T.asperellum。

圖4 以ITS序列構建zjts7菌株系統發育樹

3 結論與討論

腫節風黑斑病在南寧全年均有發生，隨著溫度的升高及降水的的增加，病害發生嚴重，防治困難，生產上依然以化學藥劑防治為主。目前關于腫節風的黑斑病菌的生物防治研究尚未見報道。本研究以廣西發生嚴重的腫節風黑斑病菌C.dematiu為靶標從健康腫節風植株的根系土壤種篩選出一株抑菌作用較強的真菌zjts7，并通過形態學和分子生物學特征將該生防真菌鑒定為棘孢木霉T.asperellum，且此真菌可造成腫節風黑斑病菌的菌絲膨大、畸形和斷裂。

棘孢木霉T.asperellum具有抑菌防病促生等功能，對多種植物病原菌具有拮抗作用。如抑制芋頭根腐病菌Pythiummyriotylum[12]、人參黑斑菌[13]、 可可黑莢病菌[14]、辣椒疫霉菌[15]、人參銹腐菌[16]、玉米大斑病菌Exserohilumturcicum[10]、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani[17-19]、核盤菌Sclerotiniasclerotiorum[10]、菠蘿黑腐病菌Thielaviopsisparadoxa[20]、鐮刀菌Fusariumsp.及腐霉菌Pythiumuhtimumsp.[10]等。楊帥等[20]研究出棘孢木霉發酵液降低番茄早疫病菌抗氧化防御酶的活力和GSH含量，增加了MDA的含量，同時其電導率顯著升高，從而抑制番茄早疫病菌的生長發育。覃柳燕等人研究出棘孢木霉PZ6菌株可在一定程度上提高香蕉苗對枯萎病菌的防御能力，提前施用PZ6菌株可有效阻止病原菌FOC4侵入香蕉苗，延緩植株發病[21]。棘孢木霉還能促進黃瓜幼苗生長[11]，誘導番茄抗灰霉病[18]。楊興堂等人研究出棘孢木霉 ACCC30536 能夠改善黃花蒿的光合能力，促進干物質的積累，從而提高其葉的產量[22]。姜傳英等人研究出這3個棘孢木霉菌株均能有效提高山新楊的光合能力，促進其生長；并且，Ta536 菌株對山新楊幼苗的誘導效果最好[23]。賀字典等人研究出用熒光定量PCR方法檢測土壤中棘孢木霉數量具有快速、靈敏度高、可靠性強等優點，可用于檢測生防菌棘孢木霉施用后的定殖量和生防效果[24]。此外，棘孢木霉對玉米灰斑病菌Magnaportheoryzae具明顯重寄生作用[10]。可見，棘孢木霉是一種具有較大潛力的生防真菌。本研究下一步工作，將對棘孢木霉zjts7菌株的抑菌機理，及其對腫節風病害的防治效果開展研究。