空氣中CO2濃度對靈芝三萜的影響及其分子機制研究*

姚 珂，韓嘉鈺，賀黎銘，余夢瑤，許曉燕，江 南，李 芳，羅 霞

（四川省中醫藥科學院菌類藥材研究所，四川 成都 610041）

靈芝[Ganoderma lucidum(Curbs:Fr.)P.Karst][1]作為我國被人熟知的傳統名貴中藥材，在多種疾病治療與預防中[2-3]，靈芝的提取物如靈芝多糖、三萜類化合物都起到不可或缺的作用[4]。目前由于科技的發展，靈芝人工栽培技術日益成熟，可以實現大規模種植。但由于種植的條件[5]、方式不同，靈芝往往只從其農藝性狀來判定品質好壞，卻忽略所得子實體中生理活性成分的含量。因此研究了如何通過控制靈芝生長時空氣CO2濃度[6-9]來提高子實體三萜含量及其相關分子機制，試驗結果不僅有利于靈芝栽培過程條件控制，還有利于提升靈芝藥材的品質，最終可以為市場輸出優質的菌類藥材原料。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

靈芝ZL13（Ganoderma lucidum），由四川省中醫藥科學院菌類藥材研究所提供。

1.2 試驗材料和試劑

木屑、棉籽殼、玉米芯、麥麩、石灰和石膏購自農資市場；葡萄糖、蒽酮、濃硫酸、香草醛、齊墩果酸、無水乙醇、NaHCO3、冰醋酸、EASYspin Plus RNA快速提取試劑盒、FastQuant RT Kit（with gDNase）、快速反轉錄試劑盒（TAKARA）、Ultra SYBR Mixture（with ROX）、Super Gelgreen染料 （10 000×水溶液）、瓊脂糖；50×TAE電泳液；基因sqs、gdp、ls、hmgr的擴增引物。

1.3 供試培養基

母種培養基：馬鈴薯浸出粉3 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

栽培種培養基：麥粒99%、石膏1%，pH自然，含水量為60%。

栽培培養基：木屑15%、棉籽殼60%、玉米芯15%、麥麩8%、石灰1%、石膏1%，pH 5～6，含水量60%左右。將木屑、麥麩、棉籽殼、石灰和石膏混合均勻，摻入預濕24 h的玉米芯、棉籽殼中拌勻，最后將混合均勻的栽培料堆料發酵3 d。選用17 cm×33 cm×0.05 cm的聚丙烯袋，每袋裝濕料1 kg，121℃高壓滅菌3 h，冷卻至室溫后每袋接入小麥粒原種10 g左右。

1.4 培養條件和栽培方法

菌絲生長階段的培養溫度為27℃，避光，濕度60%；出芝階段培養條件為光照1 000 lx，濕度85%～90%，日間溫度25℃，夜間溫度22℃。

菌絲滿袋后，打開封口膜，將每個菌袋口接種部分的基質除去，按照下列條件設置進行出芝試驗：溫度27℃，相對濕度80%，光照1 000 lx～1 200 lx。

設置低、中、高三個濃度組，通過調節通氣量，以保證環境中CO2濃度維持在穩定范圍內。處理1（CO2低濃度組）：全天不間斷排氣，環境CO2濃度在0.05%～0.06%（500 mg·L-1～600 mg·L-1）；處理2（CO2中濃度組）：全天每小時排氣10 min，環境CO2濃度在0.08%～0.09%（800 mg·L-1～900 mg·L-1）；處理3（CO2高濃度組）：完全封閉，全天不排氣，環境 CO2濃度在 0.13%～0.14% （1 300 mg·L-1～1 400 mg·L-1）。靈芝生長試驗均在人工氣候培養箱內完成。

1.5 采樣方法

子實體取樣方法：根據靈芝子實體生長特性，將靈芝生殖生長期分為4個階段：原基形成期（菌絲扭結呈白色圓狀或橢圓狀）、菌蕾期（白色子實體原基開始分化突起，子實體后端表面出現褐色）、開片期（靈芝子實體前段開始橫向生長呈扇形，有淡黃色和白色邊緣）、成熟期（靈芝子實體淡黃色邊緣消失，完成孢子彈射），每個時期取3個重復樣品，采樣后將樣品按照《中國藥典》（2015年版）的要求，烘干并打碎成粉末，過20目篩后，放置于自封袋內，備用待測。

1.6 靈芝三萜的測定方法

靈芝子實體中總三萜類化合物含量的測定，參照《中國藥典》（2015年版）中靈芝三萜的測定方法[10]。

1.7 總RNA的提取

操作前，將要使用的去RNA酶的移液器槍頭和離心管放于高壓蒸汽滅菌鍋中，在121℃高壓蒸汽滅菌20 min。其余試驗器械在高溫烘箱中180℃溫度烘干6 h。

總RNA的提取依照EASYspin Plus RNA快速提取試劑盒說明進行。

1.8 RNA質量檢查

上述所提取的RNA樣品濃度和質量，通過核酸蛋白測定儀器（SmartSpec Plus） 和濃度為1.5%的瓊脂糖電泳驗證。

RNA質量的檢測和定量分析：取RNA樣品10 μL，稀釋10倍，在核酸檢測的儀器紫外光下，檢測RNA樣品的A260/A280數字并讀取RNA濃度。

RNA完整性的檢測：每20毫升的新鮮的1×TAE液體中，添加0.3 g固體瓊脂糖凝膠，加熱溶解使其完全混合均勻，按每20毫升瓊脂糖凝膠加入1 μL的比例添加Super Gelgreen染料，傾盡模具中，常溫中凝固，拔出制孔梳。清洗電泳槽并向其中倒入新鮮TAE緩沖液，放入制備好的瓊脂糖凝膠，各取 RNA 樣品 5 μL，加入 1 μL 6× loading buffer，點樣，電泳（80 V，20 min）。凝膠成像儀觀察（Gel Doc XR），拍照記錄。符合下游要求的RNA樣品，即為提取成功。

1.9 逆轉錄

將上步已經成功提取的總RNA，通過購買的快速反轉錄試劑盒（TAKARA） 反轉錄為第一鏈DNA（cDNA）（引物是 Oligo d（T） primer），逆轉錄產物用于接下來的實時熒光定量PCR（RT-PCR）。取2 μg總RNA為模板，構建20 μL反應體系，具體操作流程參照快速反轉錄試劑盒說明進行。

1.10 定量PCR

采用Primer5并參考相關文獻綜合而得到基因gpd、hmgr、sqs、ls的擴增引物[11-12]。以cDNA為模板，進行常規PCR分析。即分別點5 μL擴增樣本加入到1.5%瓊脂糖凝膠里，電泳（80 V、20 min）。凝膠成像儀觀察，拍照記錄。

按照Ultra SYBR Mixture（withROX） 試劑盒提供的方法，把cDNA模板逐步按梯度稀釋，優化反應體系，使用iCycler iQTM實時熒光PCR檢測系統進行熒光定量PCR分析。50 μL反應體系的成分為：2×擴增緩沖液 25 μL、正向引物 （10 μm） 1 μL、反向引物 （10 μm） 1 μL、模板 DNA 2 μL，加雙蒸水至 50 μL。

每個反應體系重復3次。

采用兩步法進行PCR擴增，程序為95℃預變性10 min；95℃變性 15 s，62℃退火/延伸 1 min，40 個循環。溶解曲線分析：95℃反應1 min，55℃反應1 min，55℃反應15 s。在退火/延伸步驟，62℃時進行實時熒光系統采集。

基因gpd是靈芝生長過程中必需表達的管家基因，在靈芝體內表達相對穩定，故選擇基因gpd為內參基因，其余所測目標基因均通過基因gpd校正。靈芝子實體時間變化規律試驗中，以低CO2濃度組靈芝子實體和原基期子實體所測基因表達量定義為1，其余處理各個基因的表達量表征為相應倍數，根據 2-ΔΔCt法[13]計算。

2 試驗結果

2.1 空氣中CO2濃度對靈芝子實體形態、總三萜含量變化規律的影響

2.1.1 空氣中CO2不同濃度對靈芝子實體形態變化的影響

空氣中CO2不同濃度處理組，靈芝整個生殖生長時期不同階段子實體形態的變化情況見圖1。

圖1 不同CO2濃度處理組靈芝子實體生長形態Fig.1 Growth morphology of Ganoderma lucidum fruiting body in different concentrations of CO2

從圖1可以看出，空氣中的CO2濃度對靈芝子實體形態影響顯著。在靈芝原基生長期，CO2低濃度組子實體原基形態較為膨大且覆蓋整個、單一且覆蓋整個菌袋口生長，并有少許分化跡象；CO2中濃度組和CO2高濃度組子實體原基叢生且較小，CO2濃度越高，原基形態發育越細長。從整個靈芝生殖生長階段來看，CO2低濃度組子實體具有明顯的菌蓋和不明顯的菌柄，而CO2中濃度組具有明顯的菌柄，與CO2低濃度組相比靈芝子實體菌蓋形態差異不大；CO2高濃度組，即空氣CO2濃度大于0.1%處理組靈芝子實體不形成菌蓋，子實體只伸長生長，最終形成細長的鹿角狀靈芝。有研究表明空氣CO2濃度[14-15]主要影響靈芝子實體菌蕾發育和菌蓋開片的情況。

2.1.2 空氣中CO2濃度對子實體不同生長期內總三萜含量變化規律的影響

空氣中CO2濃度對靈芝子實體總三萜含量變化規律的影響結果見圖2。

圖2 不同CO2濃度組靈芝子實體不同生長期內總三萜含量變化Fig.2 Changes of total triterpene in the different growth stage of Ganoderma lucidum in different concentrations of CO2.

由圖2可以看出，CO2低濃度組靈芝子實體總三萜含量隨靈芝子實體生長發育出現先升高，到靈芝子實體成熟后略有下降；CO2中濃度組靈芝子實體總三萜含量呈一直上升的趨勢；CO2高濃度組靈芝總三萜含量一直維持在一定范圍內保持不變。在子實體發育的各個時期，隨空氣中CO2濃度的升高，靈芝子實體總三萜含量也呈升高趨勢，其中在子實體發育早期差異更明顯。有研究表明，空氣中CO2濃度不僅影響靈芝子實體總三萜含量，而且對不同生長期靈芝總三萜含量的變化規律也有明顯影響[14-17]。

圖3 CO2濃度對不同生長期靈芝子實體中hmgr、sqs、ls基因表達的影響Fig.3 Effect of different concentrations of CO2on the relative expression of gene hmgr,sqs,ls of Ganoderma lucidum in different growth stage

2.2 CO2濃度對子實體總三萜酸合成關鍵酶基因表達量的影響

2.2.1 溶解曲線和擴增效率的分析

內參基因gpd和3個目的基因hmgr、sqs、ls的熒光定量PCR溶解曲線均為單峰，這表明擴增產物特異性較好。

對內參基因和3個目的基因的擴增效率進行分析，擴增效率接近100%，且相對偏差小于5%，可以認為4個基因的擴增效率一致，因此，對不同CO2濃度處理組靈芝子實體三萜酸合成3個關鍵酶基因的表達分析可采用2-ΔΔCt法。

2.2.2 CO2濃度對子實體總三萜合成關鍵酶基因表達量的影響

CO2濃度對不同時期靈芝子實體中總三萜合成途徑關鍵酶基因表達的影響如圖3所示。

由圖3可以看出，在靈芝子實體生長的原基形成期和菌蕾期，CO2濃度的升高促進了基因hmgr表達量的增加，而在靈芝子實體成熟期CO2濃度的升高使基因hmgr的表達量減少。在原基形成期，CO2中、高濃度組中sqs基因的表達量不及CO2低濃度組，而從菌蕾期開始，CO2中、高濃度組中sqs基因的表達量明顯地高于CO2低濃度組，特別是成熟期CO2高濃度組，sqs基因表達量高于其余2組10倍以上。在靈芝子實體生殖生長的各個時期，ls基因的表達量均隨CO2濃度的升高呈階梯升高的趨勢。結合靈芝總三萜的含量來看，ls基因的表達量與總三萜含量變化趨勢一致。

2.2.3 不同CO2濃度組各生長期各基因表達量的變化規律

將不同CO2濃度組原基形成期所測基因的表達量定義為1，研究不同CO2濃度組在各生長期基因表達量的變化規律，結果見圖4～圖6。

圖4 各生長期不同CO2濃度組基因hmgr表達量變化Fig.4 Change of relative expression of gene hmgr of each growth stages in different concentrations of CO2

圖5 各生長期不同CO2濃度組基因sqs表達量變化Fig.5 Change of relative expression of gene sqs of each growth stages in different concentrations of CO2

圖6 各生長期不同CO2濃度組基因ls表達量變化Fig.6 Change of relative expression of gene ls of each growth stages in different concentrations of CO2

從圖4～圖6可以看出，隨著靈芝子實體的生長，hmgr基因的表達量逐漸增加，在開片期表達量會有所下調，但成熟期hmgr基因的表達量又會明顯上調。這說明CO2濃度未影響hmgr基因表達量的變化規律。對于sqs基因來說，在菌蕾期和開片期CO2中、高濃度組中其表達量明顯增加，在成熟期又有所下調；而CO2低濃度組sqs基因表達在子實體發育后期較原基形成期相對偏低。3個濃度組中，ls基因的表達量只在CO2低濃組中菌蕾期有小幅下調，其余均隨靈芝子實體生長而增加。結合總三萜的變化規律來看，ls基因相對表達量的變化幅度與三萜含量的變化規律一致。

3 討論

從形態學上觀察可知，原基形成期低濃度CO2更適宜靈芝原基的生長，菌蕾期適當地升高CO2濃度有利于靈芝菌柄的形成，但在開片期靈芝則無法承受較高的CO2濃度，當CO2濃度高于0.1%時靈芝將不能形成菌蓋。這表明，靈芝子實體在不同生長階段對CO2濃度的承受力不同，其中子實體形成期＞原基形成期＞菌絲生長期。但CO2濃度調控靈芝子實體菌蓋形成的具體作用機制尚不明確，猜測可能與一些子實體內部激素的調控有關[18]。

空氣中的CO2濃度對靈芝子實體三萜含量的變化有顯著的影響。當CO2濃度高于0.1%時，子實體中三萜含量較高；在靈芝子實體發育的早期（原基形成期和菌蕾期），CO2濃度也對靈芝三萜含量影響較大；而成熟期時由于靈芝自身三萜的合成，CO2濃度對其含量的影響反而較小。

在子實體發育的原基形成期和菌蕾期，高CO2濃度組靈芝子實體生物合成基因hmgr和基因ls的表達水平與子實體三萜含量呈正相關關系；在子實體開片期和成熟期，高CO2濃度組基因sqs和基因ls的表達水平與靈芝子實體三萜含量呈正相關關系。高CO2濃度影響靈芝子實體三萜含量的升高，這可能是通過調控靈芝三萜合成途徑相關基因的表達實現的。靈芝整個生殖生長周期中，CO2高濃度和中濃度組中，基因hmgr、sqs、ls的表達量在其他時期均高于原基形成期，而CO2低濃度組中菌蕾期和開片期基因sqs的表達量卻較低，這可能是導致CO2低濃度組中靈芝三萜含量不高的原因。不同CO2濃度組基因ls表達量在不同生長期的變化規律與子實體總三萜含量的變化規律高度一致。在已知的MVP合成途徑中，羊毛甾醇合酶（LS）是合成靈芝三萜中羊毛甾醇的關鍵，因此推斷基因ls的表達可能與靈芝三萜的合成多少相關。CO2濃度可能主要通過誘導基因ls的高表達以提高靈芝三萜含量。在靈芝子實體原基形成期，CO2濃度可能同時誘導了基因hmgr和基因ls的表達上調，因此造成三萜含量的差異較大。