羊肚菌菌種的分離與純化和形態(tài)鑒定

康曉彤

（沈陽(yáng)市同澤高級(jí)中學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110013）

羊肚菌（Morchella sp.），俗稱羊肚菜、羊肚蘑、木耳蘑菇、狼肚菜等[1]。羊肚菌口感好，風(fēng)味獨(dú)特，而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[2-3]。據(jù)分析測(cè)定，每100克干品羊肚菌中含水分12.86 g、脂肪3.82 g、蛋白質(zhì)22.06 g，其中蛋白質(zhì)含量是木耳（Auricularia auricula） 的2倍，是香菇（Lentinus edodes） 的1.5倍，且極易被人體吸收[4]。現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)和醫(yī)學(xué)研究表明，羊肚菌是一種高級(jí)營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)品，具有補(bǔ)腎、壯陽(yáng)、補(bǔ)腦、提神的功能[5-6]。對(duì)頭暈失眠、腸胃炎癥、脾胃虛弱、消化不良、飲食不振等有良好的療效[7]。同時(shí)還對(duì)腫瘤有抑制作用，對(duì)大腸桿菌和枯草桿菌也有抑制作用[8]。長(zhǎng)期食用可以防癌抗癌、抑制腫瘤、預(yù)防感冒、增加人體免疫力[9-10]。以羊肚菌為原料的保健品已得到美國(guó)Food and Drug Administration的正式許可。美味羊肚菌的菌絲體適合液體培養(yǎng)法培養(yǎng)菌絲[11]，菌絲體中含有子實(shí)體固有的營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性成分，能較好地保持子實(shí)體的獨(dú)特風(fēng)味，且羊肚菌菌絲體的生產(chǎn)較子實(shí)體的生產(chǎn)更容易[12]。因此，羊肚菌純菌種的分離具有十分重要的意義，是野生馴化、人工栽培的前提和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采自沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)后山的野生羊肚菌子實(shí)體。

本次試驗(yàn)所采集的子實(shí)體為2017年5月上旬采集。采后除去表面異物及菌柄基部泥土等，編號(hào)后用無(wú)菌紙包裹裝入盒內(nèi)，及時(shí)拿回實(shí)驗(yàn)室以供分離用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織分離法

將超凈工作臺(tái)清理干凈，把酒精燈、火柴、無(wú)菌水、刀片、鐵絲、濾紙、培養(yǎng)基、鑷子、細(xì)繩、報(bào)紙、一次性手套等放到工作臺(tái)上。接通電源，打開紫外燈開關(guān)照射殺菌約20 min。打開電源，將子實(shí)體放入超凈工作臺(tái)，開無(wú)菌風(fēng)使工作臺(tái)預(yù)熱工作10 min，帶好手套，用鑷子夾取75%的酒精棉將超凈工作臺(tái)表面和手擦拭滅菌[13]。將新采集的羊肚菌子實(shí)體放在超凈臺(tái)上對(duì)菌蓋部位進(jìn)行分離，取菌蓋內(nèi)部組織，切成大小均勻的方塊。具體操作方法見表1。

表1 羊肚菌菌蓋內(nèi)部組織的分離方法

1.2.2 孢子分離法

用滅過(guò)菌的刀片沿縱向?qū)⒆訉?shí)體切開。然后先用75%的乙醇棉球?qū)⒆訉?shí)體的表面及凹陷處擦1遍，再用無(wú)菌水沖洗，沖洗后用無(wú)菌濾紙吸水，然后用無(wú)菌棉球吸干水分。如此重復(fù)3次后，將子實(shí)體的菌蓋朝下，無(wú)菌操作后懸掛于三角瓶棉塞下端的鐵絲彎鉤上。用高壓聚丙稀透明塑料膜包好，做標(biāo)簽，注明接種情況及接種日期[14-15]。

1.3 培養(yǎng)

接種后的三角瓶和試管均置于室內(nèi)（18℃～20℃）避光培養(yǎng)[16-17]。定期觀察菌絲生長(zhǎng)狀況，記錄菌絲萌發(fā)時(shí)間、長(zhǎng)勢(shì)、菌落大小、污染情況和成活率，并做詳細(xì)記錄。

1.4 羊肚菌菌種的再純化

經(jīng)培養(yǎng)觀察，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)污染的菌種進(jìn)行進(jìn)一步的純化試驗(yàn)，挑取少許菌落，進(jìn)行斜面劃線培養(yǎng)。

1.5 羊肚菌菌種的液體培養(yǎng)觀察及顯微觀察

在液體培養(yǎng)羊肚菌時(shí)，對(duì)其進(jìn)行宏觀觀察，觀察菌絲球的狀態(tài)、顏色和菌液的清澈度。另外，挑取少量菌絲，置于載玻片上，制成菌絲玻片標(biāo)本，利用顯微鏡觀察菌絲狀態(tài)并照相[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌組織分離的結(jié)果

羊肚菌子實(shí)體組織分離結(jié)果如圖1所示。

圖1 羊肚菌組織塊接種培養(yǎng)情況

由圖1可以看出，羊肚菌子實(shí)體組織分離后總體長(zhǎng)勢(shì)一般，部分試管長(zhǎng)勢(shì)良好。這可能與組織塊菌絲的活力和滅菌效果有關(guān)。滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)抑制菌絲的生長(zhǎng)。

2.2 羊肚菌孢子分離的結(jié)果

羊肚菌子實(shí)體孢子分離結(jié)果如圖2所示。

圖2 孢子分離母種接種情況

由圖2可以看出，由孢子分離得到的菌種菌絲效果很好，菌絲呈乳白色，長(zhǎng)勢(shì)致密，無(wú)污染的現(xiàn)象。這可能是因?yàn)樽訉?shí)體彈射的孢子活力強(qiáng)。

2.3 羊肚菌的純化效果

羊肚菌的純化結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 組織分離母種的純化結(jié)果

圖4 孢子分離母種的純化結(jié)果

由圖3和圖4可以看出，經(jīng)過(guò)孢子分離得到的菌種純化后污染情況較少，菌絲生長(zhǎng)旺盛、茂密，可以證明孢子分離母種的純化效果更好一些。

2.4 羊肚菌菌絲體顯微鏡下觀察

顯微下觀察標(biāo)準(zhǔn)的羊肚菌菌絲體形態(tài)和分離得到的羊肚菌菌絲體的形態(tài)，見圖5和圖6。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)的羊肚菌菌絲體形態(tài)

圖6 分離得到的羊肚菌菌絲體形態(tài)

由圖5和圖6可以看出，經(jīng)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)篩選得到的羊肚菌菌絲與標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌菌絲狀態(tài)基本一致，長(zhǎng)勢(shì)良好，說(shuō)明孢子分離得到的菌種是羊肚菌菌種，且菌絲純度較高。

2.5 液體培養(yǎng)結(jié)果

對(duì)由孢子分離的菌種進(jìn)行液體培養(yǎng)，經(jīng)22℃，120 r·min-1搖床培養(yǎng)6 d，結(jié)果見圖7～圖12。由圖7～圖12可以看出，液體培養(yǎng)初期菌絲逐漸由少變多、形成小球，液體培養(yǎng)中期菌絲球越來(lái)越多、越大，后期菌絲球更大，整個(gè)培養(yǎng)期間，菌液清澈透明，沒有污染，說(shuō)明所獲菌種純度較高且具有較強(qiáng)的活性，因此該菌種可進(jìn)一步用于生產(chǎn)驗(yàn)證。

圖7 液體培養(yǎng)初期

圖8 液體培養(yǎng)初期

圖9 液體培養(yǎng)中期

圖10 液體培養(yǎng)中期

圖11 液體培養(yǎng)后期

圖12 液體培養(yǎng)后期

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采集沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)后山的羊肚菌，對(duì)其進(jìn)行了組織分離和孢子分離，結(jié)果表明孢子分離法效果較好。通過(guò)孢子分離法得到了1株羊肚菌菌株，并進(jìn)行了純化，純化后菌絲體白色、絨毛狀，整體生長(zhǎng)狀態(tài)較好，顯微觀察結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌菌絲體形態(tài)相符。液體培養(yǎng)菌絲球大小適宜，密度均勻，整個(gè)培養(yǎng)期間，菌液清澈透明，沒有污染，說(shuō)明所獲菌種純度較高且具有較強(qiáng)的活性，該菌種可進(jìn)一步用于生產(chǎn)驗(yàn)證。