秀珍菇種質遺傳多樣性分析與優質菌株篩選*

陸 娜，王偉科，宋吉玲，袁衛東，閆 靜

（杭州市農業科學研究院，浙江 杭州 310024）

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius），原產于印度，又名印度鮑魚菇，隸屬于擔子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目 （Agaricales） 白蘑科 （Tricholomataceae） 側耳屬（Pleurotus），屬于平菇大類中的肺型側耳，原系熱帶和亞熱帶的1種野生食用菌，經馴化育種后開始人工栽培[1]，秀珍菇是近年來從眾多食用菌品種中脫穎而出的最受消費者喜愛的優良食用菌品種之一[2]。隨著秀珍菇設施栽培模式的不斷更新和改進，由傳統春秋兩季栽培模式逐漸向栽培效率和收益更高的夏季設施栽培模式發展，然而適合高效設施栽培的環境專用型品種卻未能得到及時有效地更新同步，可供企業、菇農選擇的栽培品種較少，同時已應用的品種經常出現異種同名或同種異名現象，因此造成秀珍菇品種混亂[3]，加上秀珍菇設施栽培生產中常出現菇體色澤不佳、菇蓋薄、易破碎、出菇整齊度不高等問題，目前急切需要色灰、蓋厚、不易碎、出菇整齊度高，適應反季節設施栽培模式的優質秀珍菇品種，以滿足市場不斷提高的質量要求，為促進杭州市秀珍菇產業健康穩步發展提供品種和技術支撐。ISSR分子標記技術可以輔助提供有效的基因組信息，在側耳的分子系統發育學研究中具有可行性，能快速確定各栽培菌株之間的遺傳關系，其可以產生豐富的多態位點，更好地揭示了種下分類群間的關系[4]。因此，采用ISSR分子標記技術并結合秀珍菇栽培特性進行種質遺傳多樣性分析，旨在為篩選出適合高效設施栽培的秀珍菇菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和來源

供試的36個秀珍菇菌株均由杭州市農業科學研究院蔬菜所菌種站從秀珍菇主產區收集，經過擴繁培養，采用同一菌齡的菌株開展試驗后所得，詳見表1。

1.2 培養基和培養方法

菌絲體培養：從PDA平板上培養3 d的菌落邊緣取2 mm×2 mm的菌絲塊，接種于100 mL PDA液體培養基中，25℃淺層靜置培養10 d，收集菌絲，無菌水漂洗2次后，無菌濾紙吸干水分，于-80℃保存備用。

母種培養：采用PDA培養基，在無菌條件下進行接種后放置于25℃培養箱內培養10 d左右，于-4℃保存備用。

原種培養：采用棉籽殼78%、麩皮20%、石灰1%、石膏1%，含水量為65%的培養基，高壓滅菌后在無菌條件下接種，放置于25℃培養箱內培養。

栽培種培養：采用棉籽殼39%、木屑39%、麩皮20%、石灰2%，含水量為63%的培養基，高壓滅菌后在無菌條件下接種，放置于25℃培養箱內培養。

1.3 秀珍菇基因組DNA的提取和濃度測定

供試的36個秀珍菇菌株的DNA提取方法參照新型快速植物基因組DNA提取試劑（百泰克生物技術有限公司BioTeke，北京） 的說明，提取后測定DNA濃度，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-20℃保存備用。

1.4 ISSR引物選擇

從美國哥倫比亞大學（UBC）公布的100條ISSR通用引物中篩選出18條ISSR引物，具體見表2，然后委托杭州擎科生物公司進行合成。

1.5 ISSR多態性分析

ISSR-PCR的擴增體系為：2×TSINGKE PCR Maste（rblue）預混體系10 μL，ISSR引物1 μL，DNA模板（20 ng·μL-1）3 L，加 dd H2O 補齊到 20 μL。

ISSR的PCR擴增反應在TC-XP型（博日科技有限公司Bioer，杭州）上進行。反應條件為94℃預變性5 min；然后94℃變性30 s，適當退火溫度退火30 s（退火溫度視引物而定，詳見表2），72℃延伸90 s，35個循環；72℃延伸7 min，于16℃保存。

PCR擴增后產物采用1.5%的瓊脂糖凝膠（EB染色）進行電泳檢測，150 V下電泳30 min。擴增圖譜的攝取采用Chemi Doc XRS imaging system（Bio-Rad，Hercules，CA，USA） 進行拍照，有ISSR帶譜的統計為1，無ISSR帶譜的統計為0，構建初始數據矩陣，采用NTSYSpc2.1軟件計算遺傳相關系數，非加權組平均法（UPGMA，unweighted pair-group method with arithmetic means） 進行聚類分析，得出聚類圖譜。

表1 供試秀珍菇菌株Tab.1 Tested strains of Pleurotus geesteranus

表2 ISSR引物名稱及退火溫度Tab.2 The name of ISSR primers and the annealing temperature

1.6 出菇試驗

出菇試驗在秀珍菇設施化栽培大棚中進行，每個菌株挑取發菌完好的菌袋150袋，每50袋1次重復，設3次重復，每袋干料重650 g。以優質高產為主要指標進行篩選，記錄前3潮產量和各菌株農藝性狀。

2 結果與分析

2.1 ISSR多態性分析與菌株聚類

ISSR多態性分析與菌株聚類試驗，結果見圖1。

圖1 引物UBC827的PCR擴增圖譜Fig.1 PCR amplification map of primer UBC827

由圖1可以看出，利用ISSR引物對36個秀珍菇菌株的基因組進行PCR擴增，ISSR-PCR擴增圖譜顯示，其中18條ISSR引物在36個秀珍菇菌株間擴增出146條清晰、穩定的多態性片段，片段長度在 500 bp～2 000 bp。

2.2 DNA擴增圖譜聚類分析

基于ISSR擴增圖譜進行36個秀珍菇菌株DNA擴增圖譜聚類分析，結果見圖2。

圖2 基于ISSR分析的秀珍菇菌株聚類樹狀圖Fig.2 Cluster dendrogram of Pleurotus geesteranus strains based on ISSR analysis

由圖2可以看出，不同來源秀珍菇菌株遺傳相似系數在0.66～1.00，當相似系數為0.66時，其可被分為2個類群；當相似系數為0.82時，被分為4個類群；而當相似系數為1.00時，被分為7個類群。其中秀珍菇菌株X18和X27聚為1組；菌株X15、X38、X28、X29聚為1組；菌株X13、X31、X12、X35各為單獨1組；其余26個秀珍菇菌株聚為1組，相似系數為1.00，很有可能為同一個菌株。36個秀珍菇菌株的遺傳相似系數變異范圍在0.66～1.00，表明秀珍菇遺傳差異較大，背景豐富。

2.3 菌株農藝性狀比較

通過遺傳多樣性分析，從36個秀珍菇菌株中選擇9個代表性菌株，按編號1～9分別是X3、X4、X28、X11、 X35、X23、X12、 X27、X31，主栽菌株TX5766（編號為10）作為對照品種，進行出菇試驗并評價。

2.3.1 秀珍菇菌株菌絲長勢和產量比較

秀珍菇菌株菌絲長勢和產量比較，結果見表3。

從表3可知，各秀珍菇菌株平均滿袋天數和產量間均存在顯著差異。菌絲生長最快的是4號、10號菌株，滿袋天數分別為45 d和45.5 d；最慢的是1號菌株，滿袋天數為50 d。從前3潮菇產量來看，5號菌株平均產量最高，達0.326 kg·袋-1，其次是10號菌株，為0.283 kg·袋-1，5號菌株平均產量比對照菌株高15.2%；而其余參試菌株的平均產量均低于主栽對照菌株10號。

表3 秀珍菇菌株產量比較Tab.3 Comparison of yields of Pleurotus geesteranus

2.3.2 各參試菌株栽培和商品性狀比較

各參試菌株栽培和商品性狀比較，結果見表4。

由表4可知，秀珍菇5號、10號、8號3個菌株菌蓋顏色深灰色，比較符合市場中菌蓋色深的要求；而從出菇密度方面分析，秀珍菇5號、10號、1號和2號菌株出菇密度比較高；從成菇率方面分析秀珍菇5號和10號菌株較高；從菌蓋平展度方面分析，秀珍菇3號、10號和8號菌株整體菇型更秀美。綜合分析農藝性狀，秀珍菇5號、3號菌株比較符合市場需求。

3 小結

ISSR分子標記技術是鑒別食用菌菌株遺傳多樣性的常規方法，其具有非常高的多態性，使用的引物較長、退火溫度較高，相對于SRAP、RAPD分子標記技術有較強的穩定性和重復性，比較能夠準確反映出菌株間的親緣關系，已廣泛應用到秀珍菇、香菇、金針菇、銀耳等食用菌遺傳鑒定中。本試驗利用ISSR引物對36個秀珍菇菌株基因組DNA進行PCR擴增，發現秀珍菇菌株的遺傳相似系數變異范圍在0.66～1.00，將36個秀珍菇菌株聚為7個群，這表明秀珍菇遺傳差異較大，背景豐富。

表4 秀珍菇菌株栽培和商品性狀Tab.4 Cultivation and commercial characteristics of Pleurotus geesteranus strains

研究秀珍菇菌株的遺傳背景后，從不同類群中挑選出具有代表性的秀珍菇菌株進行反季節設施栽培出菇試驗，通過產量、農藝性狀等綜合數據分析后得出，5號菌株表現較為突出，產量比常規對照菌株高15.2%，并且在子實體色度、出菇密度、成菇率等性狀方面表現最好，符合市場需求。可見，秀珍菇5號菌株為值得推廣的設施栽培菌株。