食用菌漆酶的提取與應用技術研究進展

任紅艷，張瑞琴，張婷婷，張飛龍*，方炎明

（1.西安生漆涂料研究所，陜西 西安 710077；2.南京林業大學生命科學學院，江蘇 南京 210037）

食用菌是可食用的大型真菌，具有較高的營養價值和藥用價值，在分類上屬于菌物界（Fungi）真菌門（Eumycota；Mycobionta），絕大多數屬于擔子菌亞門（Basidiomycotina），如平菇、香菇；少數屬于子囊菌亞門（Ascomycotina），如羊肚菌。目前可人工栽培的食用菌種類有數十種[1]。食用菌在生長發育過程中分泌大量漆酶，對其本身的細胞分化、生長發育、子實體防御有重要意義，漆酶的存在能夠縮短食用菌成長周期，降低生產成本，提高食用菌抗雜菌能力。

漆酶（EC 1.10.3.2） 是以銅離子為活性中心的含糖多酚氧化酶，歸類于藍色多銅氧化酶家族，能夠催化酚類物質或者多酚類物質[2-5]形成對應的醌。1883年，日本科學家Yoshida[6]從漆樹汁液中分離得到可以催化酚類反應的物質，1894年Bertrand G[7]成功將這種能夠催干漆酚成膜的金屬蛋白提取出來并命名為漆酶（laccase）。

漆酶作為生物蛋白酶，具有參與生物體應激防御反應、細胞壁重建以及腐殖質代謝等功能。食用菌漆酶是1種胞外酶，大量存在于食用菌培養基殘渣中，因其優良的特性受到眾多研究者的青睞。國內食用菌研究主要側重于食用菌的栽培技術和菌種選育等方面，而對于生產后菌渣的開發和利用報道極少。食用菌栽培菌渣中含有大量的漆酶，充分利用漆酶可以提高食用菌利用率，降低生產成本，延長食用菌產業鏈，對食用菌產業持續發展、提質增效具有進步意義。

1 漆酶的主要來源

漆酶普遍存在于植物、微生物、動物等的器官或組織中，根據漆酶來源可以分為植物漆酶、微生物漆酶、動物漆酶等。植物漆酶主要來源于雙子葉植物綱 （Dicotyledoneae） 無患子目 （Sapindales） 漆樹科（Anacardiaceae） 的樹種，如漆樹、芒果樹等，在植物愈傷組織形成和木質素合成過程起到重要作用[8]。微生物漆酶可細分為真菌漆酶和細菌漆酶，真菌漆酶主要來源于子囊菌綱（Ascomycetes）、擔子菌綱 （Basidiomycetes） 和半知菌綱 （Deuteromycetes）等的真菌微生物，主要起降解木質素的作用[9]；細菌漆酶主要來源于球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）、固氮螺菌屬（Azospirillum）、地中海海洋性單胞菌屬[10-12]，細菌漆酶主要參與孢子色素合成與維持銅離子平衡過程[13]。

目前，實際應用于工業生產的主要是真菌漆酶，食用菌是真菌漆酶的主要來源之一。研究表明，漆酶與食用菌生長呈正相關[14]，通過篩選食用菌漆酶高產菌株、基因工程技術構建等，為漆酶應用于食品加工方面提供理論基礎。1953年Freudenberg[15]對蘑菇擠出液展開研究，研究表明蘑菇中多酚氧化酶可能參與了蘑菇菌株的木質化過程。Marques de Souza[16]研究表明秀珍菇在菌絲生長時會向胞外分泌漆酶，漆酶參與菌絲體的發育過程。食用菌栽培時添加漆酶制劑，能有效抑制雜菌污染，漆酶還與真菌的色素形成有關，通過催化反應參與分生孢子色素合成。

2 漆酶提取技術

漆酶提取是指將漆酶從生物體中分離純化的過程，一般會涉及到過濾、層析、電泳、等點聚焦等技術手段。漆樹漆酶的提取主要通過以下途徑：收集生漆→有機溶劑沉淀→收集不溶物→去雜質（溶解于磷酸鹽緩沖液）→粗品漆酶提取（超濾）→漆酶純化（鹽析、透析、層析）→再純化（等電聚焦、電泳等）→漆酶活性成分收集。

真菌漆酶多為糖蛋白，其分子量差異很大。部分菌株產生的漆酶由數種同工酶組成，但皆為糖蛋白與單體酶。多數真菌漆酶存在于真菌發酵液與食用菌培養基殘渣中，過濾掉菌體即可提取，部分真菌漆酶是胞內酶，需先進行細胞破碎后再提取。真菌漆酶的獲得主要通過以下途徑：選取菌種→培養菌種→優化條件→菌種發酵→發酵液過濾 （棄菌體）→粗漆酶提取（鹽析、等電點沉淀、有機溶劑分級分離等手段）→純化漆酶（凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析）→漆酶再純化（電泳、等電聚焦）→漆酶活性成分收集。

食用菌漆酶的提取方法與以上方法類似，通過以下途徑獲得：食用菌菌渣收集→過濾分離（棄菌體）→粗漆酶提取（鹽析、等電點沉淀、有機溶劑分級分離等手段）→純化漆酶（凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析）→漆酶再純化（電泳、等電聚焦等方式）→漆酶活性成分收集。

食用菌漆酶與漆樹漆酶的獲得方式只在前期獲得粗品的步驟存在區別，后期的精細純化提取基本相同。試驗表明，食用菌漆酶的提取與培養碳源、pH、表面活性劑和溫度密切相關[17]。漆酶催化反應的適宜反應溫度較低，T Saito[18]等從土壤中分離純化得到真菌（毛殼菌科）胞外漆酶，經測試其氧化丁香醛嗪的最適pH為7.0，最適溫度為42℃，漆酶在4℃下穩定288 h，25℃和40℃下半衰期分別為150 h和20 h。

3 漆酶的結構與活性

3.1 漆酶的結構

典型的漆酶大多由單一多肽組成，一般含有約500個～550個氨基酸，分子量約 60 kDa～70 kDa，并伴有不同程度的糖基化，其含糖量和種類因漆酶來源不同而存在差異。晶體研究表明，目前得到的所有真菌漆酶結構都呈杯蛋白構型，相對的分成三區，每區均具有β-圓桶狀、螺旋、loop拓撲構型[19]。大多數漆酶有3個銅離子結合位點，結合有4個銅離子，分別是1個Ⅰ型或藍型銅，順磁性，氧化狀態在614 nm左右有強吸收，1個Ⅱ型或通常型銅，順磁性，無特征吸收，2個Ⅲ型或偶聯的雙核型銅，反磁性，氧化狀態在330 nm左右有強吸收。Hukulinen等[20-21]對漆酶蛋白質晶體結構進行研究，發現4個銅離子位于漆酶蛋白的中央空穴，組成了具有特定三維構型的三核銅簇活性中心。

3.2 漆酶的活性

漆酶的活性通常指漆酶的催化氧化作用，漆酶的催化氧化機理非常復雜，漆酶的氧化還原電勢大都在0.5 v～0.8 v，能夠直接氧化酚型芳香族化合物和其他負電子化合物，將氧分子直接還原為水。反應機理如圖1。首先Ⅰ型Cu2+和Ⅱ型Cu2+分別從底物處接受1個電子變為一價銅離子Cu+，然后發生分子內電子轉移，將電子傳遞給Ⅲ型銅偶合離子對使它們從二價變為一價，而Ⅰ型和Ⅱ型銅離子又重新變為二價型銅離子，二價型銅離子可以再從底物分子接受電子而變成一價銅離子。當四個銅離子都為一價時漆酶處于還原態。在存在氧氣條件下，還原態漆酶可被氧化然后脫水恢復到氧化態。這樣漆酶通過四個銅離子的相互協同作用傳遞電子同時發生價態變化，從而實現對底物的催化氧化作用。

圖1 漆酶對漆酚的催化氧化機理Fig.1 Mechanism of catalyzed oxidation of urushiol by laccase

漆酶是1種糖蛋白，極易因受到溫度、pH、介質、電磁場和糖鏈等的影響而改變其空間結構，從而導致漆酶活性發生改變，漆酶活性受外界因素影響的原因還在探索中。大量研究者試圖通過改變外界條件而提高漆酶的反應活性，比如改變反應介質、將漆酶固定化、增加反應底物官能團等方式。Hao Li等[22]研究了磷酸鹽官能化碳點（PCD） 對漆酶催化活性的影響，表明漆酶/PCDS雜化材料能夠有效提高漆酶的催化活性。Sijie Guo[23]研究了金納米顆粒對漆酶可見光誘導催化反應活性的影響，表明納米顆粒與酶之間的相互作用對于漆酶催化劑的分子設計有指導意義。

3.3 漆酶的活性測定

漆酶與多數酶一樣能夠與某些特定的物質（丁香醛連氮、愈創木酚、α-萘酚、焦性沒食子酸等）在短時間內發生顯色反應，因此一般通過分光光度法、微量熱法、脈沖激光光聲法等測定漆酶，其中有關分光光度法測定漆酶的報道較多，Suyan Qiu等[24]根據3-疊氮香豆素與云芝漆酶的相互作用，提出了漆酶的測定方法。Seyed[25]將愈創木酚衍生物（DDG）作為1種底物與漆酶發生反應，并開發了新型漆酶檢測裝置，通過利用分光光度法測定了粗壯神經孔菌漆酶的動力學參數，2-甲氧基-4- [（4-苯基）] 偶氮苯酚 （Km＝93.5 μm，v＝1.98 μm·min-1) 也被鑒定為能夠準確和常規分光光度法測定漆酶的適宜底物。

4 漆酶的生物化學特性

漆酶具備多種生理生化功能，廣泛參與植物的形態發生、與植物寄主相互作用、生物體應激防御反應以及木質素降解等過程。漆酶一般都有不同程度的糖基化，而糖基化可能對漆酶的分泌、活性、溫度和pH等有重要影響。漆酶作為生物蛋白酶，具有參與生物體應激防御反應、細胞壁重建以及腐殖質代謝等功能。

4.1 參與菌株形態發生與發育

食用菌漆酶參與細胞壁形成，并在食用菌子實體的防御中發揮作用，漆酶還能夠參與食用菌子實體的呼吸作用，促進子實體生長發育，菌株生長過程又能夠生產漆酶，二者相互協調。

4.2 參與木質素的降解過程

木質素是多個單元通過穩定的醚鍵和碳碳鍵連接而成的多酚類三維網狀高分子芳香族化合物，其結構復雜，且能夠很好的抵御外界的侵擾與降解。真菌漆酶通過與其他微生物酶（過氧化物酶、錳過氧化物酶、木質素修飾酶等）共同作用，切斷木質素高聚物之間的連接鍵，并將其側鏈氧化，從而將木質素分解成小分子物質，被真菌或者細菌利用，達到降解木質素的目的[26]。

4.3 氧化化學制劑中氯酚類化合物與苯胺類取代物等

氯酚類化合物與苯胺類取代物被廣泛用于染料、防腐劑、殺菌劑、殺蟲劑和除草劑等的生產中，是目前水土污染的主要污染源之一，有強致毒性[27]。漆酶通過其本身的氧化還原作用能夠與有機污染物發生催化氧化反應，將污染物轉化過濾為大分子聚合物或者生成無毒無害的化合物，因此被廣泛用于污水處理、環境治理等領域。

5 漆酶的應用技術

5.1 食品加工

漆酶在果汁澄清[28]、面粉烘焙[29-30]、葡萄酒釀造[31]、食用菌栽培等方面具有重要作用。飲料中的酚類化合物極易被氧化導致果汁渾濁、顏色深、口感差，漆酶能夠氧化酚類化合物并與之發生聚合反應形成大分子物質，達到澄清果汁的目的[32]。目前面粉添加劑一直存在安全隱患，漆酶能夠提高面粉的強度與穩定性，且有望取代傳統的面粉改良劑[33]。Charlotte L[34]發現漆酶存在交聯能力，能夠誘導催化氧化生物蛋白，在食品等行業具有應用潛力。Struch等[35]研究表明，漆酶能夠促使酸奶蛋白凝膠化，改善酸奶加工過程中機械攪拌對酸奶品質的影響。黃曲霉素多見于發霉的糧食、糧制品及其他霉腐的有機物上，其毒素的危害性在于對人和動物肝臟組織有破壞作用。王會娟等[36]采用培養基平板培養法和液體發酵法對平菇菌株產漆酶的能力進行比較分析，篩選得到高產漆酶的平菇菌株，表明漆酶在降解食品黃曲霉素方面效果明顯。食用菌栽培過程中添加漆酶制劑可促進食用菌菌絲生長、原基形成，從而縮短生產周期、提高產量。

5.2 造紙工業

造紙行業難以解決的技術難題是木質素的脫除，木質素含量直接影響到紙漿質量和色澤，傳統造紙行業一直使用氯漂法脫除木質素，但漂白過程會產生含有大量有機芳香族等有毒污染物的污水，對環境污染嚴重。而木質素高聚物在酶的作用下，結構單元連接鍵會斷裂，側鏈也會發生化學反應，從而分解成小分子物質。因此酶解法能夠避免造紙過程的二次污染。

真菌漆酶屬微生物降解酶體系，試驗表明，多種酶共同作用會提高木質素的降解能力。Jan P[37]研究了漆酶降解木質素過程中的氧化還原電位變化，為木質素降解的研究提供了基本保障。

目前，研究者對漆酶及其介質系統的研究報道較多，Jie Jiang[38]將漆酶用于2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基（TEMPO）/漆酶/O2體系，在不添加任何含氯氧化劑的情況下，將木質纖維素降解成纖維素納米纖維（CNFs），有效降低了能耗，但其缺點是需要消耗大量的TEMPO和漆酶。Qiang Fu[39]研究了聚乙烯亞胺-TEMPO（PVAm-T） /漆酶復合物對木質素的降解反應，提出PVAm-T/漆酶的吸附結構與電化學性能直接影響木質素的降解能力。Haifeng Zhou[40]研究表明堿木質素在漆酶/木聚糖酶系統下能夠被有效降解，木聚糖酶的加入可以提高漆酶的活性。Daniela Huber[41]考察了氧氣和介質對漆酶催化木質素磺酸鹽聚合的影響，表明外部氧氣供應比漆酶介質的存在更有益于木質素的降解反應。張鵬飛等[42]發現細菌漆酶對木質素表現出較強的降解作用，并且細菌漆酶降解能力高于枯草芽孢桿菌。

5.3 染整

染整是指對紡織材料（纖維、紗線和織物）進行以化學處理為主的工藝過程，現代也通稱為印染。染整同紡紗、機織或針織生產一起，形成紡織物生產的全過程。染整包括預處理、染色、印花和整理。染整質量的優劣對紡織品的使用價值有重要的影響。傳統的染整工藝需要耗用大量化學物質，污染嚴重。酶染整工藝是采用生物酶進行染整加工的環境友好型的染色工藝，具有效率高、反應條件溫和、操作安全、無毒害污染等優點。多項研究表明[43-44]，生物氧化還原酶能夠被用于染整工業，采用漆酶和纖維素酶對牛仔布進行同浴酶洗整理，可使織料表面光潔，而處理液基本保持無色[45]。鄭小靜等[46]采用纖維素酶和漆酶對木棉纖維進行預處理，結果表明經過漆酶處理后，木棉纖維微觀結構變小，熱解溫度降低約10℃，吸水率較未處理前增加25%左右，靛藍染色K/S值在6以上，染色效率得到有效提高。

5.4 生物轉化

酶氧化反應具有反應條件溫和、反應底物廣泛、催化專一、不會對環境產生危害等特點，與傳統氧化反應相比，在有機物合成方面的應用潛力巨大。芳香族和稠環化合物多為化學合成工藝中的前體物質，而漆酶能夠利用氧分子為電子受體，氧化含酚羥基的芳香族化合物。

Kengo Akagawa[47]研究表明，漆酶作為助催化劑，在特定反應條件下，與肽一起催化不對稱R-氧氨化反應，得到產物醛或者羧酸，其可以取代傳統金屬催化劑，與有機物體系的擴展也會有助于綠色化學的發展。Junhe Lu[48]研究了漆酶在催化氧化鹽酚（XPs）過程的動力學過程，解釋了部分多鹵產品在環境媒體中的起源。Linson Lonappan[49]研究了農產漆酶降解雙氯芬酸的動力學過程及其轉化產物。漆酶氧化產物單一，來源廣泛，成本較低，易分離純化，且具有環境友好性，因此漆酶氧化技術在有機合成方面應用前景廣闊。

5.5 生物電化學

生物傳感器（biosensor）主要用于分析檢測，具有專一性強、分析速度快、準確度高等優點。漆酶是制備生物傳感器的優良材料，采用漆酶的傳感器靈敏度高，專一性強，能夠廣泛應用于醫療、環境等在線檢測等領域。

Leite[50]利用漆酶和過氧化物酶制備了具有協同效應的雙酶生物傳感器，可用于在線檢測兒茶酚胺。近年來，漆酶用于生物電極的報道越來越多，Tao Wang[51]采用漆酶替代金屬催化劑制成漆酶生物電極（DET），用于亞砷酸鹽/砷酸鹽生物傳感器，靈敏度為（0.91±0.07） mV·mm-1，可用于地下水中無機砷、砷酸鹽和亞砷酸鹽等污染物的監測。

生物燃料電池是指利用酶或者微生物組織作為催化劑，將燃料的化學能轉化為電能的發電裝置。研究表明，采用漆酶的生物燃料電池效果明顯，Qin Qian[52]將漆酶用于酶促生物燃料電池中，考察了離子液體對生物電極相容性的影響。Theodore Lazarides[53]首次利用卟啉敏化漆酶體系的四電子還原作用，在光驅動下將氧分子還原成水，使有氧光驅動轉換的想法變得合理。漆酶也因其優良的特性在生物系統中應用前景廣闊。

5.6 污水處理

工業氯酚類廢水、紙漿和造紙工業廢水、染料和印刷廢水、城市廢水、受污染的土壤等對生態環境造成極大的危害，污水處理問題已成為生態環境保護中急需解決的問題。工業污水中含有大量的有機污染物，比如腐殖質、類脂化合物、含氮有機物、烴類化合物等，采用傳統污水處理方法見效慢、成本高，易產生二次污染，不適合大規模應用，而漆酶能夠通過其本身的氧化還原作用有效降解有機污染物，在污水處理方面應用廣泛。

Jinyuan Hu[54]提供了漆酶在氧氣存在條件下將As（III） 氧化成As（V） 的數據，并解釋了漆酶在反應中失活的原因，為酶解法的優化和治理砷污染的潛在發展提供了基礎。Qi Luo[55-56]成功利用漆酶誘導催化反應降解全氟辛烷磺酸，該反應是以1-羥基苯甲酸三唑（HBT）為介質的氧化腐殖化反應，為降解全氟辛烷磺酸污染提供了潛在途徑。Rupam Sarma[57]研究了層狀自組裝漆酶反應膜對氯代有機物的降解反應，表明功能化膜與漆酶結合能夠極大提高漆酶對氯代有機物的降解效率。

偶氮類染料具有致癌作用，偶氮類染料污水處理一直是個技術難題。劉文華等[58]優化了毛栓菌產漆酶的條件，并考察了毛栓菌酶對于偶氮染料AR1和RB5的降解能力，越來越多的研究表明漆酶用于污水處理具有有效性和可行性。

6 結語

6.1 食用菌副產物開發利用技術研究極具前景

食用菌產業作為一項投資小、周期短、見效快，符合人們消費增長和農業可持續發展的需要。近年來，食用菌的栽培技術、食用價值和藥用價值研究受到廣泛關注，而食用菌培養副產物開發利用技術研究較少，大量的食用菌栽培菌渣被廢棄，造成極大浪費，因此食用菌菌渣漆酶提取技術有待進一步的開發和利用。

6.2 漆酶應用技術研究大有發展

人們利用蛋白質分離提取技術從食用菌培養基中獲到漆酶，并通過光譜學、動力學和晶體學等方法，進一步了解漆酶結構和催化機制。近年來，漆酶在多個領域的應用技術也被廣泛研究，但仍然存在諸多問題：

目前漆酶催化活性研究取得了重要進展，漆酶在木質素降解、廢水處理、生物轉化等方面潛力巨大，漆酶的應用為人類開發利用食用菌副產物提供了全新的途徑。然而，由于漆酶生物催化的分子機理和調控技術還需要全面分析和進一步的明確、驗證，因此漆酶的應用研究尚處于實驗室階段，要實現工業化應用還需不斷努力。這也是漆酶實用技術研究的世界難題和創新研究的焦點。

盡管漆酶具有反應底物廣泛，反應條件溫和的特點，但在強酸強堿或者高溫等環境中易失活，影響了漆酶的實際應用。因此，需要通過高通量篩選具有高活性、高穩定性的產漆酶菌株，以提高漆酶不同環境下的存在能力。

食用菌漆酶工業化應用研究與食用菌副產物價值的開發需要被業界關注，這是科學工作者面臨的令人振奮的挑戰。