不同用途酵母菌株環境適應性差異研究

王學東， 周建軍， 付國靜,， 胡駿鵬， 劉 瓊，胡先勤， 羅青平， 王海燕， 孫 敏

（1.武漢輕工大學，湖北武漢 430023；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；3.思科福（北京）生物科技有限公司，北京 100081；4.農業部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室，湖北武漢 430064；5.北京挑戰生物技術有限公司，北京 100081）

飼用酵母能促進動物新陳代謝，增強食欲，有利于動物的消化吸收，加速動物的生長發育及生產性能的發揮，還能提高動物的抗病、防病能力（Hatoum等，2012）。作為一株優良的飼用酵母，其應能夠耐受動物消化道內高酸性、高濃度膽酸鹽的惡劣環境，并具有產氣量小，發酵穩定等優點（譚斌，2008）。本研究選取不同用途酵母菌株，對其環境抗逆性，即酸脅迫耐受性和膽酸鹽耐受性進行研究，初步探討造成不同酵母菌株此種差異的環境抗逆性機理，并對其產氣能力進行對比，研究不同用途酵母菌株產氣能力的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 無糖酵母 （無糖高活性干酵母）、耐高糖酵母（耐高糖高活性干酵母）、高酒酵母（福邦釀酒干酵母）、布拉迪酵母（可利貝健抗腹瀉專用干酵母）、畜禽酵母（畜禽專用干酵母）、反芻酵母（反芻專用干酵母）均由湖北宜昌安琪酵母股份有限公司提供。

1.1.2 培養基 瓊脂培養基、YPD培養基均為國產。

1.1.3 試劑 鈉標準溶液、鉀標準溶液、硝酸、氯化銫、乳酸、牛膽鹽等均為國產。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌菌液的培養 取適量制備好的酵母菌懸液，用紫外分光光度計以無菌液體YPD為對照測其吸光度，調節菌液濃度OD600=0.8±0.02。

1.2.2 酵母菌酸脅迫耐受性

1.2.2.1 不同pH環境酵母菌生長情況 在滅好菌的液體YPD培養基中加入適量乳酸 （85.0%～90.0%）調節其 pH 分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0（空白組），分別取1 mL調節好濃度的菌液接種于不同pH液體YPD培養基中，搖床培養，利用分光光度計法，每隔2 h測定其在波長600 nm下的吸光值，至24 h，觀察酵母菌種在各pH下的生長情況。

1.2.2.2 酵母培養液中Na+、K+濃度測定 取制備好的釀酒酵母發酵液5 mL，經3000 r/min離心10 min，取上清液再用定量濾紙過濾后（約為4 mL），作為原樣品液低溫貯存。加熱消化，直至無色透明為止。加入適量水加熱去除多余的硝酸。待燒杯液體接近2～3 mL時，冷卻，用去離子水洗并轉移到10 mL刻度試管中，加水定容至刻度。取適量質量濃度為1000 mg/L的Na+、K+標準儲備液，配制標準系列使用液，濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL。 將消化樣液、試劑空白液、標準稀釋液分別導入火焰，測其發射強度。樣品中元素含量計算公式：

式中：x為試樣中元素的含量，mg/100 g；c為測定用試樣液中元素的濃度，μg/mL；c0為試劑空白液中元素的濃度，μg/mL；V為試樣液定容體積，mL；f為試樣液稀釋倍數；m為試樣的質量，g。

1.2.3 酵母菌膽酸鹽耐受性

1.2.3.1 不同膽酸鹽濃度環境酵母菌生長情況取適量制備好的菌懸液，在600 nm波長處用液體YPD培養基調節其OD值為0.8±0.02，在膽鹽濃度為 0%、0.30%、0.60%（牛膽鹽，Solarbio，中國）的液體YPD中培養24 h后，參考國標GB4789.15-2010，計數cfu/mL計算其存活率，平行3組。計算公式為：

1.2.3.2 酵母細胞內海藻糖含量測定 精確稱取鮮酵母0.1000 g（精確至0.0002 g）于離心管中，加入4.0 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液于振蕩器振蕩混勻后置于帶有冰塊的冰水中，每15 min振蕩一次，共1 h，于離心機3000 r/min離心5 min，將上清液倒入50 mL容量瓶中，用冰水洗滌離心管及沉淀，振蕩混勻后，再放入高速離心機中設定轉速和時間3000 r/min離心5 min，將上清液倒入50 mL容量瓶中，然后用冰水稀釋至刻度，搖勻。

式中：X為試樣中海藻糖的百分含量，%；E為試樣的吸光度；6.29為當E=1時，每毫升溶液中含海藻糖的質量，mg；W為試樣質量，g；Ds為試樣干物質的百分含量，%。

1.2.4 不同酵母菌株產氣特性 采用Risograph酵母活性測定儀測定不同酵母不同發酵時間產氣量。稱取 （50±0.2）g樣品放入特定的量殼體里面，溫度30℃，時間12 h，酵母活性測量儀內置微處理器含有一個精準的采樣時鐘和輸出緩沖器，保證測定結果的可靠性和精確度。RisoSmart軟件給出發酵能力電子數表和曲線，進而分析和報告結果。

2 結果與分析

2.1 不同酵母菌種酸脅迫耐受性

2.1.1 不同pH環境培養酵母菌的生長曲線 通過低pH沖擊試驗，采用紫外分光光度計測定酵母在不同pH環境下的生長情況，從圖1可以看出，6株不同酵母均可在低酸性環境中生長，且在不同pH環境中的存活率隨pH下降而降低。其中，布拉迪酵母、反芻酵母和畜禽酵母3種酵母菌株在較低pH環境中的存活率均高于其余3種。由此可知，不同的pH環境對酵母菌的生長有非常顯著的影響，且不同酵母菌株對環境酸脅迫耐受性有顯著差異。

2.1.2 酵母培養液中Na+、K+濃度 從圖2可以看出，6種酵母培養液，Na+和K+的濃度均隨pH的降低而降低。有研究表明，Na+在生物膜上具有運輸特性，即同向運輸和反向運輸同時進行，其濃度變化在細胞內呈動態平衡（張國順等，2004；Isreal于50 mL容量瓶中加入4.0 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液，用冰水稀釋至刻度，搖勻，作為空白溶液。吸取空白及樣品1.00 mL于兩個潔凈干燥的試管中，再分別精確加入蒽酮試液5 mL，振蕩搖勻，沸水浴中反應時間為10 min，拿出立即將樣液溫度冷卻至室溫，再次搖勻，放于分光光度計630 nm處，用1 cm比色皿測定吸光度，以空白作對照。試驗樣品中海藻糖積累量的計算公式如下：等，1993），試驗中，Na+濃度明顯降低可能是由于酵母細胞處于高酸性環境中時活菌數減少導致其從胞內釋放到環境中的Na+減少。K+濃度的降低表明，酵母細胞在處于高酸性環境中時確實有大量K+進入細胞，維持胞內酸堿環境的穩定，從而使得酵母細胞可以在高酸性的惡劣環境中存活。試驗結果顯示，反芻酵母、布拉迪酵母和畜禽酵母3株試驗用酵母菌株培養液中Na+濃度相對較高，而K+濃度相對較低，說明這3株酵母菌株的酸脅迫耐受性較其余幾株酸脅迫耐受性強，此結果與6株試驗用酵母菌株的生長曲線結果一致。

圖1 6種酵母菌株在不同pH環境中培養生長情況

圖2 6種酵母在不同p H環境培養24 h后培養液中金屬離子濃度變化

2.2 不同酵母菌株膽酸鹽耐受性

2.2.1 不同膽酸鹽濃度環境培養酵母菌的生長曲線 通過膽酸鹽耐受性試驗，用紫外分光光度計測定酵母菌在不同膽酸鹽濃度環境中的生長情況。從圖3可以看出，6株不同酵母菌株均可在高濃度膽酸鹽環境中生長，且呈現相同的生長趨勢。在未加入膽酸鹽的培養基中，6株酵母菌株均在培養6 h時出現快速增長，到12 h后趨于平穩，進入穩定期。在膽酸鹽濃度為0.3%的培養基中，培養0～6 h時OD600呈下降趨勢，說明有大量菌體死亡；之后開始增加。在膽酸鹽濃度為0.6%的培養基中，培養到10 h時OD600才開始增加，說明隨著膽酸鹽濃度的增加，酵母菌體受到的損害越大。其中，布拉迪酵母、反芻酵母和畜禽酵母3種酵母菌株在較高膽酸鹽濃度環境中的存活率均高于其余3株，說明其膽酸鹽耐受性較其余酵母菌株更佳。

圖3 6種酵母菌株在不同膽酸鹽濃環境中培養生長情況

2.2.2 酵母菌細胞胞內海藻糖積累量 從圖4中可以看出，6種酵母胞內海藻糖積累量隨膽酸鹽濃度的增加而降低，這可能是由于酵母細胞處于高濃度膽酸鹽環境中時其細胞結構受到損害，部分細胞死亡所致。6株供試酵母菌胞內海藻糖含量由高到低排列的順序為：反芻酵母、布拉迪酵母、畜禽酵母、高酒酵母、耐高糖酵母、無糖酵母，此結果與其生長曲線結果一致，說明反芻酵母、布拉迪酵母、畜禽酵母較其余用途酵母菌株膽酸鹽耐受性更佳。

2.3 不同酵母菌株的產氣特性 作為一株優良的飼用酵母菌株，尤其是反芻動物專用飼用酵母菌株，其應具備產氣量小、發酵穩定的特點（Hofmann等，2008）。從圖5中可以看出，6株不同酵母菌株均可持續穩定的發酵，并產生一定量的氣體。其中，無糖酵母和高糖酵母兩種酵母產氣量最高，畜禽酵母和布拉迪酵母次之，反芻酵母和高酒酵母最低。

圖4 6種酵母在不同膽酸鹽濃度培養24 h后胞內海藻糖積累量

圖5 6株不同用途酵母菌株總產氣情況

3 討論

不同用途的酵母菌株需具備不同的特性，作為一株優良的飼用酵母菌株，其必須可耐受動物消化道內的低pH和高濃度膽酸鹽環境，在通過動物的胃部到達消化道內時具有良好的活性（Didari等，2014）。本試驗通過對供試的6種不同用途的酵母菌株進行環境抗逆性比較，并對其機理進行初步探究。6株酵母菌株均可在較低pH環境和較高濃度的膽酸鹽環境中生長，但不同用途酵母菌株對環境酸脅迫耐受性及膽酸鹽耐受性表現出顯著差異，供試6株酵母菌株中，作為飼用酵母菌株使用的3株酵母菌株，即布拉迪酵母、反芻酵母和畜禽酵母表現出較強的酸脅迫耐受性和膽酸鹽耐受性。且其細胞內金屬離子Na+和K+濃度及胞內海藻糖積累量均與其相對應的環境耐受性表現出一致的變化趨勢，說明當酵母細胞處于較為惡劣的生長環境中時，其細胞內的一些物質會做出相應的應激反應保護其細胞免受損害而存活。

不同用途的酵母菌株的產氣能力存在差異，發酵面食專用酵母菌株如高糖酵母，應具有較好的產氣能力（蘇東海，2008），而飼用酵母若產氣能力好產氣量大，在動物進食后其進入動物消化道內會引起動物腹脹，如可能會引起反芻動物的瘤胃膨氣（王山宏等，2006），因此，飼用酵母應具備產氣量小的特點，尤其是反芻動物專用飼用酵母菌株。本試驗分析了6種不同用途的酵母菌株的產氣特性。其中，反芻酵母產氣能力最差，無糖酵母與高糖酵母產氣能力相對較好。

4 結論

不同用途的酵母菌株的環境耐受性及產氣能力存在差異，不同菌株的酸脅迫耐受性與其細胞內Na+、K+濃度變化有密切關系，膽酸鹽耐受性與其胞內海藻糖積累量密切相關。研究試驗菌株中布拉迪酵母、反芻酵母和畜禽酵母3株酵母菌株的酸脅迫耐受性和膽酸鹽耐受性較其余3株酵母菌株強，且6株供試酵母菌中，反芻酵母、畜禽酵母和布拉迪酵母的產氣能力均在中等產氣能力以下，故此3種酵母菌株適合作為飼用酵母益生菌株使用。