棉纖維發(fā)育的遺傳特性及相關(guān)基因的研究進展

毛 瑋，曹躍芬,2

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州311300；2.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 浙江省作物種質(zhì)資源重點實驗室，浙江 杭州310058）

棉纖維是由外珠被表皮層的單細胞分化發(fā)育而成，分為長絨（lint）和短絨（fuzz）2種，長絨是高級棉紗紡織品的主要原材料，短絨主要用做制作纖維素、絮棉、紙張及紡織品的原料。在已有的四倍體棉種中，陸地棉Gossypium hirsutum和海島棉Gossypium barbadense已經(jīng)被馴化為栽培種［1－3］。目前世界上97%的棉纖維都產(chǎn)自陸地棉，產(chǎn)量高且適應(yīng)性廣，但是纖維品質(zhì)中等；海島棉產(chǎn)量低，適應(yīng)性差，栽培范圍不廣泛，但是其纖維更長且品質(zhì)高。如何獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的棉種，一直是遺傳育種學(xué)家關(guān)注的焦點。而隨著遺傳學(xué)、細胞學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的交叉融合，棉纖維生長發(fā)育分子機制已成為國內(nèi)外研究的熱點。探明棉花種子表皮細胞生長發(fā)育的分子基礎(chǔ)，對于提高棉花產(chǎn)量及改良纖維品質(zhì)至關(guān)重要。早期有關(guān)棉纖維發(fā)育研究大多集中于遺傳定位。大量與纖維品質(zhì)和產(chǎn)量相關(guān)的數(shù)量性狀位點（QTL）通過圖位克隆的方法被發(fā)現(xiàn)于各個染色體［4－5］，而光子顯性基因Li1，Li2，N1和Fbl以及光子隱性基因n2，sma-4（fz）和sma-4（ha）［6］等一直備受關(guān)注。近年來，深度測序技術(shù)的興起，對棉纖維發(fā)育的分子機制的研究起了有效的推動作用。隨著深度測序技術(shù)的不斷革新，棉花全基因組測序不斷完善［7］，全基因組微衛(wèi)星序列得以注釋［8］， 單核苷酸多態(tài)性（SNP）芯片的開發(fā)成為可能［9］， 使得遺傳定位工作更加便捷［9－10］。 轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)及表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域三方位的深度測序有效構(gòu)建了核糖核酸（RNA）水平和蛋白質(zhì)水平、編碼區(qū)域和非編碼序列之間的聯(lián)系，并發(fā)現(xiàn)一系列的轉(zhuǎn)錄因子、編碼轉(zhuǎn)脂蛋白的基因、鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、多糖合成相關(guān)蛋白、大量的微核糖核酸（miRNA）以及脫氧核糖核酸（DNA）甲基化作用等共同參與棉纖維發(fā)育過程［11－16］。本文將從棉纖維發(fā)育各時期的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及特征，經(jīng)典遺傳學(xué)研究，深度測序技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)及表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的運用，以及棉纖維發(fā)育各個時期所涉及的相關(guān)調(diào)控基因等4個方面對棉纖維發(fā)育機制的研究進展進行綜述。

1 棉纖維發(fā)育各時期的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化特征

棉纖維細胞發(fā)育進程是一個多基因調(diào)控的有序的系統(tǒng)發(fā)生過程，整個細胞分化過程可被分為棉纖維起始、伸長、次生壁合成與增厚、脫水成熟等4個時期［17－20］。

1.1 棉纖維起始期

長絨纖維細胞一般在開花前或開花當天就開始突起，而短絨纖維的突起要稍遲幾天，兩者的分化過程基本相似［21］。RAMSEY等［22］通過觀察開花前16 d到開花當天胚珠的亞顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)開花前16 d到前3 d表皮細胞無差異，說明纖維原始細胞的分化與突起晚于開花前3 d。而在開花前2～3 d纖維原始細胞受生長素（IAA）和赤霉素（GA3）的刺激開始產(chǎn)生纖維［11］，開花當天，纖維原始細胞的分化與突起已基本完成。棉花纖維原始細胞分化與突起多少決定種子表面纖維數(shù)量，從而決定了棉纖維的產(chǎn)量。

1.2 棉纖維伸長期

研究發(fā)現(xiàn)一般只有25%～30%的棉花種子表皮細胞（約2萬個）能正常突起伸長，形成成熟的纖維［23－24］。棉纖維的伸長幾乎和突起同時進行，從開花當天開始，發(fā)生在細胞壁膨脹過程，纖維的最終長度取決于纖維伸長速率和持續(xù)時間2個方面［25］，一般持續(xù)20～30 d，該過程通過一種擴散生長機制實現(xiàn)并指導(dǎo)纖維細胞的極化生長［26－27］。纖維伸長分為非極性膨脹和極性伸長2個階段：非極性膨脹期決定了纖維的細度，纖維細胞向四周擴展直至形成纖維的最終直徑［28］；極性伸長期可使纖維長度達到最終長度的80%［29］，這一時期生化反應(yīng)最為活躍，主要決定纖維的長度，是影響纖維品質(zhì)的關(guān)鍵時期［24］。

1.3 棉纖維次生壁合成與增厚期

棉纖維次生壁合成與增厚期和纖維伸長期存在一段時期的重疊［17］，在開花后16 d開始，持續(xù)到開花后40 d，在這段時期，纖維素大量沉積，次生壁不斷加厚［30］。伴隨著纖維素沉積的加速，纖維伸長逐漸減弱，該過程是影響纖維強度和韌性的關(guān)鍵時期。

1.4 棉纖維脫水成熟期

在次生壁合成與增厚期后就進入了纖維脫水成熟期，發(fā)生在開花后40～50 d，棉鈴開裂至充分吐絮，纖維失水，形成轉(zhuǎn)曲［31］。成熟的棉纖維由外向內(nèi)依次為初生壁、次生壁和中腔。

2 棉花纖維生長發(fā)育的遺傳學(xué)研究

遺傳規(guī)律研究和基因遺傳定位是經(jīng)典遺傳學(xué)中2項重要的基礎(chǔ)工作。在棉纖維遺傳規(guī)律研究中發(fā)現(xiàn)，相同性狀的材料基因型不同，其遺傳模式也不同，而棉纖維發(fā)育相關(guān)基因的遺傳定位又可被分成質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀（QTL）的定位。

2.1 棉纖維遺傳規(guī)律研究

CARVER［32］和KEARNEY等［33－34］研究發(fā)現(xiàn)棉花光子性狀主要由2對獨立的位點控制，顯性光子基因（N1）和隱性光子基因（n2），宋麗等［35］證實這2種光子基因均符合單基因遺傳模型。既無長絨也無短絨的L40突變體的光子性狀為不完全顯性［36］。既無長絨也無短絨的突變體Xu142 fl的短絨的發(fā)育受N1和n22對基因控制，長絨的發(fā)育受Li3基因位點控制［37］。陸地棉短絨突變體Li1和Li2均為單基因顯性遺傳［38－40］。孫亞莉等［41］選取大量的陸地棉和海島棉的光子材料對棉花光子性狀進行了遺傳分析，其研究發(fā)現(xiàn)棉花短絨多少與生態(tài)環(huán)境有關(guān)系，且不同品種光子材料的遺傳模式也不同，不論海島棉還是陸地棉材料均存在顯性、部分顯性和隱性遺傳。對3個陸地棉隱性性狀的材料進一步研究表明：這3個材料的遺傳規(guī)律均不同， ‘庫光子’的光子性狀由2對隱性等位基因控制，并且有互補效應(yīng)； ‘陸無絮’的光子性狀由2對隱性等位基因控制，基因間呈積加作用；SA65的光子性狀由單隱性基因控制。

2.2 棉纖維基因的QTL定位

纖維品質(zhì)性狀包括長度、整齊度、伸長率、強度、細度、顏色和馬克隆值等多個方面。隨著分子標記的不斷開發(fā)與應(yīng)用，在棉花染色體A組和D組染色體上都有大量棉纖維品質(zhì)和產(chǎn)量相關(guān)的QTL被發(fā)現(xiàn)（表1）。從表1可知：纖維品質(zhì)和產(chǎn)量性狀的QTL幾乎遍布了每一條染色體，且不同實驗室使用不同的群體所得到的結(jié)果也有很大差異。同時，研究也發(fā)現(xiàn)這些性狀受環(huán)境的影響很大，某些QTL在不同環(huán)境條件下有變化，甚至檢測不到，導(dǎo)致已定位的QTL間重復(fù)性差［10，42］，這也說明纖維品質(zhì)及產(chǎn)量性狀的遺傳非常復(fù)雜。研究也發(fā)現(xiàn)了一些穩(wěn)定的主效QTL，如第10號染色體的棉纖維強度主效QTL（FS1），解釋了超過30.00%的表型變異［43］；第19號染色體影響衣分的QTL（qLI17），解釋24.30%的表型變異［34］；第8號染色體上顏色相關(guān)QTL（Ge6_Rd_8_3_10.60_［+］），解釋48.00%的表型變異［5］；以及第14號染色體上與長度相關(guān)的QTL（qFL-Chr14-3），解釋15.05%的表型變異［10］，等等。此外，有些QTL雖然微效，但在不同環(huán)境下都能穩(wěn)定存在，比如WANG等［42］在8，11，12和21號染色上發(fā)現(xiàn)的6個QTL：qFLA8-1（長度相關(guān)），qFS-A8-1（強度相關(guān)），qFS-A12-1（強度相關(guān)），qFS-A12-2（強度相關(guān)），qFS-D11-1（強度相關(guān)）和qFM-A11-1（馬克隆值相關(guān)）。這些穩(wěn)定存在的QTL都值得科研工作者進一步關(guān)注和研究。

表1 不同群體中與棉纖維品質(zhì)和產(chǎn)量相關(guān)的QTL分布Table 1 QTL related to cotton fiber quality and yield in different populations

然而，棉纖維相關(guān)性狀QTL的分離和克隆仍然很少。有研究發(fā)現(xiàn)在第12條染色體上（A12/D12）與棉纖維品質(zhì)相關(guān)的QTL附近的GhHOX3基因?qū)γ蘩w維長度起重要調(diào)控作用［47］，以及定位于同源染色體A8（chr08）和 D8（chr24）上的GhSusA1 基因過表達可以增強纖維長度和強度［48］。

表1 （續(xù)）Table 1 Continued

2.3 棉纖維基因的質(zhì)量性狀定位

在光子顯性基因定位中發(fā)現(xiàn)，N1和Fbl基因位于chr12上［6］，其中N1基因被鑒定為轉(zhuǎn)錄因子MYB25-like［49］。光子隱性基因定位研究表明：n2定位在chr26上，sma-4（fz）位于L.G.A3的端部，sma-4（ha）位于L.G.A3中部［6］。超短纖維突變體Li1基因位于chr22上，并已通過精細定位被克隆到，是一個肌動蛋白家族基因［50-53］； 而Li2基因則位于 chr18 上［6，53］。

3 棉纖維發(fā)育組學(xué)研究

棉纖維發(fā)育過程涉及到大量的基因和通路調(diào)控。利用高通量測序技術(shù)，對棉纖維發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析及表觀遺傳研究，可以短時間內(nèi)獲得大量信息，捕獲到許多參與不同發(fā)育階段的特異性基因及信號通路，為下游單獨研究重要基因的功能奠定良好的基礎(chǔ)。

3.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

利用棉花胚珠體外培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析比較，KIM等［11］在纖維起始分化時期發(fā)現(xiàn)了許多在野生型和無毛突變體間表達有差異的基因，包括MYB25，MYB109，PDF1，MYB25-like，HD1等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，表明在棉纖維起始分化過程中存在復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機制。通過比較短絨突變體（Li1）與野生型之間在開花后1，3和8 d的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，LIANG等［49］在胚珠中共檢測到7 852個差異表達基因，主要參與次生代謝物和脂質(zhì)代謝途徑，其中涉及非長鏈脂肪酸生物合成的37個基因在Li1突變體纖維的快速伸長發(fā)育過程中被顯著抑制，這說明脂質(zhì)代謝途徑與纖維伸長密切相關(guān)。HOVAV等［54］評估了從開花后初級次生壁到次級次生壁合成過程中棉纖維發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組變化發(fā)現(xiàn)，棉纖維發(fā)育過程中的基因轉(zhuǎn)錄水平很高，在每個階段占到所有基因的75%～94%，并且半數(shù)以上的基因在纖維發(fā)育的至少一個階段中上調(diào)。BOLTON等［55］利用基因芯片技術(shù)和實時熒光定量PCR技術(shù)在Li1突變體中發(fā)現(xiàn)超過100個基因在次生壁的生物合成過程中差異表達，其中的3個候選基因：伸展蛋白（extensin），蔗糖合成酶（sucrose synthase）和微管蛋白（actin）的表達量明顯偏離野生型的表達水平。通過陸地棉TM-1背景下的海島棉染色體導(dǎo)入系與親本纖維的轉(zhuǎn)錄組差異比較，F(xiàn)ANG等［56］在CSIL-35431和CSIL-31010等2個導(dǎo)入系的次生壁合成過程中發(fā)現(xiàn)了大量與TM-1有表達差異的基因，功能富集分析表明這些基因主要富集于次生細胞壁的生物合成、葡糖醛酸合成、纖維素合成等生物途徑。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究

利用蛋白組學(xué)研究，許多棉纖維發(fā)育過程中的重要蛋白被不斷發(fā)掘，且此技術(shù)很好地互補了轉(zhuǎn)錄組只能在mRNA水平上研究纖維相關(guān)基因的劣勢。HU等［12］應(yīng)用相對和絕對定量（iTRAQ）LC-MS/MS分析技術(shù)研究了1 317個纖維特異性表達蛋白，其中205個蛋白在發(fā)育階段中差異表達，190個蛋白在野生和栽培棉之間差異表達。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、iTRAQ蛋白質(zhì)組和遺傳圖譜定位的綜合分析方法，MA等［13］發(fā)現(xiàn)徐州142野生型與其無絨毛突變體（fl）的胚珠之間存在大量差異表達的基因和蛋白，這些差異基因和蛋白主要存在于氨基酸、核苷酸、脂肪酸和葉酸代謝以及黃酮生物合成中，說明這些代謝途徑在纖維發(fā)育過程中具有重要作用。

3.3 表觀遺傳學(xué)研究

近年來，棉纖維發(fā)育的表觀遺傳學(xué)研究也取得了巨大進展。基于pre-miRNAs和已發(fā)現(xiàn)的miRNA靶基因數(shù)據(jù)，CHEN等［14］對83個miRNA前體及其目標調(diào)控基因進行了研究，并構(gòu)建了miRNAs及其靶位點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并揭示了這些miRNA及靶基因在纖維不同發(fā)育階段的表達模式。SONG等［15］對纖維和胚珠進行了甲基化組、轉(zhuǎn)錄組和小RNA組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在胚珠和纖維發(fā)育過程中CHH甲基化變化顯著。該研究發(fā)現(xiàn)，在胚珠中，啟動子中的CHH甲基化與可誘導(dǎo)RNA依賴的DNA甲基化（RdDM）和胚珠偏好基因上調(diào)的siRNA呈正相關(guān)；在纖維細胞中，胚珠衍生細胞產(chǎn)生獨立的RdDM的異染色質(zhì)CHH超甲基化，抑制轉(zhuǎn)座子及附近纖維相關(guān)基因的活性。使用甲基化抑制劑5-氮-2′-脫氧胞苷對胚珠進行體外培養(yǎng)，可以減少纖維細胞的數(shù)量和長度，這表明DNA甲基化在纖維發(fā)育中具有潛在作用。這些研究表明：啟動子和轉(zhuǎn)座子及附近基因中的RdDM依賴的甲基化可作為基因和轉(zhuǎn)座子表達的雙保險反饋機制。ZOU等［16］對參與纖維起始和伸長過程的長鏈非編碼RNA（lncRNA）進行了系統(tǒng)分析，共鑒定到5 996條lncRNAs，其中長鏈非編碼RNA（lincRNA）3 510條，天然反義轉(zhuǎn)錄RNA（lncNAT）2 486條，表明lncRNA對棉纖維的發(fā)育至關(guān)重要。

4 棉纖維發(fā)育不同時期相關(guān)調(diào)控基因研究

4.1 棉纖維起始期相關(guān)基因

在棉花胚珠EST數(shù)據(jù)庫中，約10%的基因與轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)，包括56個轉(zhuǎn)錄因子家族成員［57］，如 MYB 類轉(zhuǎn)錄因子家族的GL1 及其同源基因MYB2［58］，MYB109［59］，TTG1［60］和GL2［61］等均被發(fā)現(xiàn)在棉纖維發(fā)育的早期階段高效表達。棉花GaMYB2基因可以誘導(dǎo)種子表皮毛的產(chǎn)生，且轉(zhuǎn)化擬南芥可以彌補GL1突變對表皮毛起始分化造成的影響［58］。通過干擾GhMYB109的表達，PU等［62］發(fā)現(xiàn)棉纖維細胞分化延遲且起始數(shù)量減少，說明GhMYB109在棉花纖維分化階段起重要作用。LOGUERICO等［63］發(fā)現(xiàn)Gh-MYB4和GhMYB5基因在纖維分化期的胚珠中特異表達。WALFORD等［64］發(fā)現(xiàn)GhHD1可以介導(dǎo)棉花表皮細胞的分化。辛婧［65］的研究表明轉(zhuǎn)錄因子GbSPB8可能調(diào)控棉花纖維起始發(fā)育。

4.2 棉纖維伸長期相關(guān)基因

轉(zhuǎn)脂蛋白和鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白在棉纖維伸長過程中起到極其重要的作用。MA等［66］研究發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)脂蛋白GhLTP3和GhLTP6的表達量在纖維快速伸長期達到最高水平，此外李錫花等［67］發(fā)現(xiàn)GhLTP3的表達量從開花后0～15 d中表達量不斷升高，在第15天達到頂峰，之后逐漸下降。趙存鵬等［68］和GAPPER等［69］研究發(fā)現(xiàn)：鈣調(diào)蛋白CaM在低溫逆境的條件下能使活性氧（ROS）、超氧游離基、過氧化氫和羥自由基等物質(zhì)提高，進而使纖維細胞壁松弛，從而影響細胞伸長。CHENG等［70］發(fā)現(xiàn)GhCaM7-like基因在纖維快速伸長期顯著表達。HUANG等［71］發(fā)現(xiàn)鈣依賴性蛋白激酶GhCPK1在開花第10天的胚珠中高表達。這些研究都說明鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在纖維伸長過程中發(fā)揮重要作用。除了轉(zhuǎn)脂蛋白和鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子也參與其中，如ZHANG等［72］發(fā)現(xiàn)GbMYB25與GbML1相互作用并通過調(diào)節(jié)ROS信號調(diào)節(jié)纖維伸長。HSU等［73］發(fā)現(xiàn)GhMYB7可以調(diào)控LTP3等脂轉(zhuǎn)移蛋白編碼基因。

4.3 棉纖維次生壁合成與加厚期相關(guān)基因

DELMER等［74］發(fā)現(xiàn)Rac9和Rac13可以控制棉花纖維素沉積方向。ZHAO等［75］發(fā)現(xiàn)GhRGP1在纖維發(fā)育的初生壁伸長及次生壁加厚后期優(yōu)勢表達，參與植物細胞壁非纖維素類的多糖合成。楊郁文等［76］發(fā)現(xiàn)一種Ser/Thr激酶和Try激酶的雙受體蛋白GhRLK1與激活和維持次級細胞壁形成的細胞信號傳導(dǎo)過程有關(guān)。此外，GhRDL1（RD22-Like1）與GhEXPA1互作會影響纖維細胞壁發(fā)育，GhRDL1基因過表達會產(chǎn)生長且質(zhì)量較好的棉纖維［77］。

4.4 棉纖維脫水成熟期相關(guān)基因

目前，關(guān)于棉纖維細胞脫水成熟期的相關(guān)研究較少，對于纖維在脫水成熟過程中細胞與分子水平的變化還不清楚，只是猜想可能涉及到棉纖維細胞的程序性死亡［78］。

5 研究展望

隨著技術(shù)的革新，大量棉纖維發(fā)育相關(guān)基因和涉及的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)被不斷發(fā)現(xiàn)，但是基因間的相互作用及其潛在的調(diào)控機制還有待進一步探索。近年來，棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)日益成熟，新興的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)也于2017年3月在棉花基因組靶基因敲除中得到首次應(yīng)用。JANGA等［79］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功將轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白（GFP）基因棉花系的GFP基因敲除；LI等［80］以棉花內(nèi)源GhMYB25為目標基因，使用2種單導(dǎo)向RNA對該基因進行定點突變，突變率分別為100%和98.8%。這些研究表明：CRISPR/Cas9可以在棉花基因組上進行高效和高特異性地突變。隨著新技術(shù)在棉花中的應(yīng)用與成熟，棉纖維發(fā)育相關(guān)基因及其調(diào)控機制也有望有更多的發(fā)現(xiàn)。