接種不同根瘤菌對花櫚木幼苗光合生理的影響及促生效應

段如雁,韋小麗，安常蓉

（1.貴州大學 林學院，貴州 貴陽550025；2.貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009）

生物固氮是指自然界中的一些微生物將大氣中的不能被植物利用的氮氣還原成可利用的氨的過程。豆目Fabales樹種與根瘤菌在長期進化過程中形成的共生固氮體系是生物固氮中效率最高的體系，所固定的氮素約占生物固氮總量的 65%，它可以導致植物的氮素營養和土壤中化合態氮大量增加［1－2］，對于自然界氮素的生物循環和農林生產都有十分重要的作用。花櫚木Ormosia henryi屬豆目Fabales蝶形花科Papilionaceae紅豆樹屬Ormosia，主產于中國亞熱帶地區，其材質優良，是制作高檔家具、工藝雕刻和特種裝飾品的珍貴用材樹種［3］。段如雁等［4］通過對花櫚木結瘤調查發現，當年生花櫚木幼苗根瘤較少，幼苗生長細弱，其固氮效率很低。未結瘤的當年生幼苗上山造林成活率低，只有到第2年時才有部分結瘤，且結瘤幼苗在生長上、生理生化特征上都優于未結瘤幼苗 。因此，通過人工接種優良菌株，建立一個高效的花櫚木-根瘤菌共生體系是提高苗木品質的重要措施。通過研究花櫚木與根瘤菌之間的最佳匹配關系，推廣花櫚木根瘤菌的接種技術，使花櫚木獲得最佳生長效果，不僅可以提高花櫚木苗木品質和造林成活率，還可以豐富豆目樹木根瘤菌在整個根瘤菌應用研究領域的內容。目前，中國對花櫚木的根瘤菌研究較少，除筆者［4］進行過初步研究外，韓素芬等［5］對花櫚木的根瘤形態、結瘤數量進行過研究，李東等［6］對花櫚木根瘤菌的16S rDNA序列進行過分析。尚未涉及到人工接種根瘤菌對花櫚木幼苗生理和生長效應的研究。本研究擬通過對花櫚木幼苗接種不同根瘤菌試驗，測定接種不同菌株后花櫚木幼苗的光合生理指標以及苗高、地徑、生物量、根系等生長指標變化，以揭示不同根瘤菌株對花櫚木幼苗的促生效應，初步篩選出高效促生的優良根瘤菌種，為今后花櫚木育苗中人工接種根瘤菌,培育優質壯苗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花櫚木種子采自貴州省石阡縣同一母株，千粒重為（390.6±0.4）g，凈度為94.6%。移栽基質為經過121℃高溫高壓滅菌0.5 h的蛭石，育苗容器為直徑20 cm高度15 cm的塑料盆，使用前用質量分數為0.5%高錳酸鉀溶液進行消毒。

供試菌株是從貴州、浙江、安徽、福建、江西等省采集的花櫚木根瘤分離，經加有剛果紅的酵母甘露醇瓊脂（YMA）平板上劃線，28℃恒溫培養，并通過16S rDNA序列分析及回接驗證篩選出20株純化菌株（表 1）。

1.2 研究方法

選取飽滿的花櫚木種子，先用質量分數為0.1%升汞溶液浸泡10 min進行表面消毒，然后浸泡于80℃的熱水中，并讓其自然冷卻。種子吸脹后，置于無菌發芽盒中，在25℃培養箱內催芽。待芽苗長至1～2 cm時，將芽苗移栽到裝有蛭石的塑料花盆中。移栽花櫚木芽苗5株·盆－1，共移栽芽苗126盆，置于塑料大棚中培養，待花櫚木長出真葉后，接種不同的根瘤菌菌液，設置重復3個·處理-1，每個重復設10株苗，共21個處理（含不接種根瘤菌的對照ck）。

供試菌株在YMA斜面上活化后，接入YMA液體培養基中，28℃下搖床培養3 d至對數期，用分光光度計檢測菌液吸光度D（600）為0.7時即可接種。接種菌液10 mL·株－1，接種方式為直接將菌液澆灌在苗木根部，隔15 d澆1次無氮營養液，不施加其他肥料，隔30 d追澆1次根瘤菌菌液，到2016年7月抽查到苗木結瘤為止。

于2016年5月下旬，花櫚木幼苗接種根瘤菌3 d后開始測量苗高、地徑，以后測量1次·月－1，直到11月底試驗結束。接種后2個月抽查苗木結瘤情況，苗木結瘤后于8月中旬晴天測定花櫚木幼苗光合生理指標以及葉綠素熒光等指標。試驗結束后，統計各處理的結瘤數和根瘤質量，從各處理中選取標準株5株測定生物量以及根系狀況。

表1 通過16S rDNA序列分析及回接驗證的20株菌株Table 1 Twenty strains by return verifying and 16S rDNA sequence analysis

1.3 指標測定方法

1.3.1 苗高、地徑及生物量測定 用卷尺測苗高（精度0.1 cm），游標卡尺測地徑（精度0.01 mm）。生物量測定方法：選取5株標準株，將苗木洗凈擦干后放到105℃烘箱中殺青15 min，再用70℃烘（17±1）h，在干燥器中冷卻后用1/1 000電子天平稱取地上部分和地下部分干質量，單株生物量＝地上部分干質量＋地下部分干質量。

1.3.2 根系指標的測定 先將選取的花櫚木標準株沖洗干凈，用吸水紙吸干，把待測根系用根系掃描分析系統（WinRHIZO）進行根系指標的分析。

1.3.3 光合參數的測定 于8月中旬的晴天上午 9：00－11：00，各處理選擇3株標準株的功能葉片，用LI-6400便攜式光合儀測定光合速率、蒸騰速率等光合指標。測定時使用紅藍光源葉室，光照強度設置為 1 000 μmol·m－2·s－1， 二氧化碳摩爾分數設為 400 μmol·mol－1， 測定時保持葉片自然生長角度不變， 對測定的數據取平均值。葉綠素熒光參數測定：使用 Junior-PAM葉綠素熒光儀測定葉綠素熒光參數，主要包括最大光化學量子產量（Fv/Fm），PSⅡ潛在活性（Fv/Fo），實際光合量子產量（YⅡ），光化學猝滅（qP），非光化學猝滅（qN）。進行實驗前將Junior-pam連接好。將葉片暗適應30 min后放到磁性葉夾上進行實驗，在測量Fv/Fm前確保實時熒光（Ft）小于600，飽和脈沖、遠紅光強度和持續時間選用默認設置，光化光強度設置為 1 150 μmol·m－2·s－1， 點擊誘導曲線程序按扭進行自動測量。

1.4 數據統計方法

試驗數據采用Excel 2010和SPSS 22.0統計分析軟件進行分析處理。采用Duncan法進行多重比較。利用隸屬函數法對各個指標進行綜合評價［7］。

2 結果與分析

2.1 對花櫚木幼苗結瘤數和鮮瘤質量的影響

單株結瘤數和根瘤質量是評價瘤菌結瘤效率的重要指標。由表2可得：與對照相比，接種根瘤菌后，花櫚木幼苗結瘤率顯著（P＜0.05）增加，結瘤率均為90.0%以上。其中7號處理單株根瘤數最多，15號和17號次之，分別是ck的102.9，100.0和95.3倍，3號處理單株根瘤數最少，為ck的24.3倍。不同菌株處理后苗木單株根瘤質量與根瘤數變化趨勢一致。

表2 接種不同根瘤菌對花櫚木單株結瘤數和單株瘤質量的影響Table 2 Effects of inoculated different rhizobium strains on nodule number and nodule weight per plant of Ormosia henryi seedlings

2.2 對花櫚木幼苗光合速率、蒸騰速率的影響

圖1 接種不同根瘤菌對花櫚木幼苗光合速率的影響Figure 1 Effects of inoculated different rhizobium strains on photosynthetic rate of Ormosia henryi seedlings

光合速率的大小直接決定著植物光合能力的強弱。試驗結果（圖1）顯示：接種根瘤菌可以提高花櫚木幼苗的光合速率。接種不同根瘤菌的花櫚木幼苗光合速率差異顯著（P＜0.05）。與ck相比，所有接種根瘤菌處理的花櫚木幼苗葉片的光合速率都高于ck，增幅為41.6%～197.4%。接種2號、1號、9號菌株的花櫚木光合速率較高，分別比ck提高197.4%，177.9%，177.9%，說明這幾個菌株更有利于花櫚木光合能力的提高。

圖2表明：接種不同菌株對花櫚木幼苗蒸騰速率的影響差異顯著（P＜0.05）。各菌株處理的蒸騰速率變化范圍為 0.32～1.90 mmol·m－2·s－1。 蒸騰速率最高為2號菌株，是ck的6.1倍；最低為10號菌株，比ck高3.2%。蒸騰速率大于 1.00 mmol·m－2·s－1的處理有2號和3號菌株，表明這些菌株接種后有利于促進花櫚木幼苗蒸騰作用的進行。

圖2 接種不同根瘤菌對花櫚木蒸騰速率的影響Figure 2 Effects of inoculated different rhizobium strains on transpiration rate of Ormosia henryi seedlings

2.3 對花櫚木幼苗葉綠素熒光的影響

表3表明：接種不同根瘤菌的花櫚木幼苗葉綠素熒光參數差異均達到顯著水平（P＜0.05）。接種根瘤菌各處理實際光化學量子產量YⅡ均高于ck，增幅為4.8%～95.2%，其中，接種20號菌株YⅡ最大，是ck的2.0倍，表明其PSⅡ反應中心有部分關閉情況下的實際原初光能捕獲效率最高。qP為光化學猝滅，反映的是PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞的份額。接種根瘤菌各處理qP均高于ck，增幅為7.7%～51.9%，其中，接種3號菌株qP最大、8號次之，分別比對照高出51.9%和44.2%。非光化學猝滅（qN）反映的是PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能部分。qN表現為ck最大，接種20號菌株次之，5號菌株qN最小，分別是ck的75.0%和12.0%。Fv/Fm反映PSⅡ反應中心內稟光能轉化效率，Fv/Fo表示PSⅡ的潛在活性，2個指標變化趨勢基本一致，均表現為ck最小，接種20號菌株最大，分別是ck的2.1倍和4.8倍。

表3 接種不同根瘤菌對花櫚木葉綠素熒光的影響Table 3 Effects of inoculated different rhizobium strains on chlorophyll fluorescence of Ormosia henryi seedlings

2.4 對根系生長狀況的影響

從表4可以看出：接種根瘤菌對花櫚木幼苗根系生長有明顯的促進作用，各處理間花櫚木幼苗總根表面積、根平均直徑、根尖數之間差異顯著（P＜0.05）。與ck相比，接種17號菌株的花櫚木幼苗總根表面積最大，隨后依次為7號、15號、16號菌株，但三者與接種17號菌株處理間差異不顯著（P＞0.05）。接種5號菌株總根表面積最小，僅是ck的1.4倍。1～5號菌株處理均與ck差異不顯著（P＞0.05）。接種7號、12號、11號菌株對根平均直徑的提高作用較大，分別比ck高193.3%，171.1%和171.1%，1～6號菌株對花櫚木根平均直徑的影響較小，增幅均小于50%且與ck差異不顯著（P＞0.05）。6號菌株對花櫚木幼苗根尖數的生長促進作用最大，比ck提高92.1%，與其他處理差異顯著（P＜0.05）。接種7號、4號、18號、9號、15號、17號、12號、20號、16號、13號菌株的花櫚木幼苗的根尖數增幅為37.4%～53.3%，其中7號、4號、18號增幅較大，分別為53.3%，50.0%和45.8%。

2.5 對花櫚木幼苗苗高的影響

從圖3可以看出：人工接種根瘤菌有助于促進花櫚木高生長。與ck相比，接種根瘤菌的花櫚木幼苗高生長增幅為6.3%～273.8%，差異顯著（P＜0.05）。其中，苗高增長量增幅為200%以上的菌株號為15號、4號、2號；增幅為100%～200%的菌株號為1號、13號、19號、16號、7號、6號、17號、10號、18號、14號、20號；增幅為10%～99%的菌株號為9號、12號、8號、5號、3號；11號菌株對花櫚木幼苗高生長的影響最小，僅比ck高6.3%，與ck差異不顯著（P＞0.05）。

表4 接種不同根瘤菌對花櫚木幼苗根生長的影響Table 4 Effects of inoculated different rhizobium strains on roots growth of Ormosia henryi seedlings

圖3 接種不同根瘤菌對花櫚木幼苗苗高增長量的影響Figure 3 Effects of inoculated different rhizobium strains on height growth of Ormosia henryi seedlings

2.6 對花櫚木幼苗地徑的影響

接種根瘤菌對花櫚木幼苗地徑生長有明顯促進作用（圖4）。方差分析表明：不同處理間花櫚木幼苗地徑差異顯著（P＜0.05）。接種根瘤菌的花櫚木幼苗地徑增長量比ck提高37.9%～310.3%，其中增幅為200%以上的菌株號為15號、16號、13號、2號、4號、12號；增幅為100%～200%的菌株號為17號、14號、5號、19號、8號、18號、6號、1號、7號、3號；增幅小于100%的菌株號為9號、20號、20號、11號；11號處理地徑增長量最低，僅比ck高37.9%。

圖4 接種不同根瘤菌對花櫚木幼苗地徑增長量的影響Figure 4 Effects of inoculated different rhizobium strains on ground diameter increment of Ormosia henryi seedlings

2.7 對花櫚木幼苗生物量的影響

圖5表明：接種根瘤菌的花櫚木幼苗單株生物量均高于ck，增幅為10.7%～128.6%。方差分析表明：接種不同根瘤菌的花櫚木幼苗單株生物量之間差異顯著（P＜0.05）。其中，接種13號、15號菌株單株生物量最大，比ck高了128.6%；接種6號、18號、19號、12號、16號、5號、7號、17號、1號、4號菌株花櫚木幼苗單株生物量增幅均高于100%；單株生物量增幅為50%～100%的菌株處理為9號、20號、14號、11號、8號、10號；單株生物量增幅低于50%菌株號為2號、3號菌株。

圖5 接種不同根瘤菌對花櫚木幼苗單株生物量的影響Figure 5 Effects of inoculated different rhizobium strains on biomass of Ormosia henryi seedlings

2.8 接種不同根瘤菌效應的綜合評價

對各指標進行相關性分析，去除相關性較強的指標，余下地徑增長量、生物量、總根表面積、根尖數、實際光合量子產量、光化學猝滅、光合速率、總根瘤質量作為隸屬函數綜合評價指標。評價結果表明（表5）：對花櫚木幼苗生長生理促進效應最為顯著的前5個菌株號為15號、16號、18號、7號、4號，可初步作為促進花櫚木生長的優良菌株。

表5 接種不同根瘤菌株花櫚木幼苗質量綜合評價Table 5 Comprehensive evaluation of quality for Ormosia henryi seedlings with different rhizobium strains

3 討論

豆目植物接種根瘤菌后光合能力顯著提高［8－12］，其主要原因是：①與根瘤菌共生形成根瘤進行生物固氮，固定的氮素轉化成氨基酸或酞胺后，運往植物的地上及其他部位，為地上部的生長提供合成物質，增加了葉面積，提高了整個植株的碳固定水平 。②氮素供給提高了葉片中葉綠素的含量，影響天線色素的光吸收和光傳遞。 ③氮素供給促進類囊體中的電子傳遞體和煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP+）以及細胞基質中的二氧化碳同化酶（主要是1,5-二磷酸核酮糖羧酶Rubisco）等物質的合成［13］，從而提高植物的光合能力。本研究中，花櫚木幼苗接種根瘤菌后，葉片光合速率都有不同程度提高，且接種不同菌株后花櫚木幼苗的光合速率存在顯著的差別，表明不同根瘤菌與花櫚木共生固氮效率亦有所不同， 這與前人的研究結果一致［14－15］。

葉綠素熒光參數也是體現植物光合作用潛力的重要指標，通過對花櫚木葉片葉綠素熒光參數的測量可以更深入了解與電子傳遞有關的光合器官能力［9］。接菌處理后，花櫚木葉片的葉綠素熒光參數與對照相比，除qN外其余參數都有不同程度的提高，表明接種根瘤菌后，氮素營養得到補充，花櫚木幼苗的PSⅡ反應中心開放度提高，更多的光能用于驅動電子傳遞，PSⅡ的光量子效率潛能提高，對花櫚木光合作用更為有利。本研究中無論接種哪個菌株，qN都比對照低，其原因可能是未接菌處理不能通過生物固氮為幼苗提供氮素營養，屬于低氮脅迫狀態，因此PSⅡ天線色素吸收的光能更多部分不能用于光合電子傳遞，只能以熱形式耗散掉。

根系是植物吸收水分和養分的主要器官，接種根瘤菌促進了根系生長和根系對養分及水分的吸收利用。郝鳳等［16］研究結果表明：接種中華根瘤菌Sinorhizobium meliloti和不接菌相比，紫花苜蓿Medicago sativa的根長、根表面積、根平均直徑和根體積均表現為接菌比不接菌要好，本研究亦得到類似的研究結果。另一方面，地上部分所產生的光合產物向地下部分運輸，為根系的生長提供能量和碳架，生長點便成為很強的光合產物競爭部位，間接體現在根尖數的增加上。根尖數增加越高的處理，其光合產物供給能力越強。接種根瘤菌從地上部分提高光合能力，地下部分改善水分、養分的吸收，最終體現為苗高、地徑和生物量的增加。

花櫚木與根瘤菌的共生作用，是在長期的進化中相互作用、互相選擇的結果，也是與環境相適應的結果。本研究表明：在相同的條件下，花櫚木幼苗分別接種20株不同的根瘤菌菌株，雖然都可與花櫚木共生結瘤固氮，但并未獲得同樣的接種效果，說明根瘤菌和寄主之間的共生匹配關系存在差異。只有選擇合適的菌株，在共生固氮中綜合考慮宿主菌株和環境的相互關系，才有利于充分發揮共生固氮的作用，促進苗木的生長。本研究所采集的根瘤菌來自不同的區域，各自有其適生環境，雖然寄主都是花櫚木，但不同區域的的花櫚木還存在基因型上的差異，因而在相同條件下接種產生的效果不一致。因此，篩選最佳花櫚木與根瘤菌共生固氮體系，不僅要適地適菌，還要做到適苗適菌。此外，本研究對象為1年生花櫚木苗木，且育苗基質并非土壤，根瘤菌與花櫚木苗木的共生環境比較單一，因此，所篩選的促生菌株對于多年生花櫚木是否具有的促進效應，以及所篩選的優良菌株在土壤基質中是否有相同的促生效應，有待進一步驗證。