毛竹植硅體微觀形態及穩定性的掃描電鏡初探

趙麗華，黃程鵬，王悅悅，黃張婷

（浙江農林大學 理學院，浙江 杭州 311300）

植物硅酸體，簡稱植硅體，是植物內的含水非晶態二氧化硅（SiO2）顆粒，存在于植物不同部位的細胞內［1－2］。植硅體碳因具有很強的抗腐蝕、抗分解、抗氧化等特性［2－3］，可在土壤中保存數千年乃至萬年之久［4］，是陸地生態系統長期固碳的主要機制之一［5－6］，對調節全球碳平衡和應對氣候變化意義重大。當前對植硅體的研究主要集中于古環境與古氣候重現、農業與環境考古、古生態以及植物分類學等方面，基于宏觀估測和默認植硅體恒久穩定的前提進行，因此學界對土壤中植硅體的穩定性存在很大爭議。PARR等［7－8］發現：經過2 000 a的分解，土壤中植硅體碳質量分數從僅占表層土壤有機碳不到10%的比例，上升到82%，表明土壤中植硅體碳的封存是一個長期積累的過程［9］。WILDING等［4］發現：植硅體中碳的放射性年齡約為1.33萬a。因此，植硅體具有長期穩定性。也有研究認為植硅體是不穩定的。如FRAYSSE等［10］發現竹林土壤中的植硅體的溶解度等同于玻璃質硅石，是石英的17倍；BARTOLI等［11］認為植硅體的溶解速率比硅酸鹽礦物高一個數量級［11］；CONLEY等［12］發現：保存死亡植物的地方，水溶性硅的輸出明顯增加。竹類作為禾本科Poaceae中典型的硅富集植物，植硅體碳含量高，提取、純化相對方便［13－14］。其次，竹類植物分布廣泛，種類豐富［15］，不同生境竹種差異大［16］，為比較不同竹種植硅體碳穩定性差異和微觀形態特征提供了理想的材料。選擇竹類植物為研究對象，對揭示植硅體碳穩定性機理和準確估測竹類植硅體碳封存潛力具有雙重意義。掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）是由電子光學技術、真空技術、精細機械結構以及現代計算機控制技術等共同組成的電子光學儀器［17］，在植物研究工作中主要被應用于植物來源和種類鑒定、植物微形態學研究以及植物生長的優劣與環境污染等質量控制［18－19］。近年來，隨著植物和土壤植硅體碳研究的深入，掃描電子顯微鏡等先進儀器也被應用到植硅體碳測定上［20－21］。本研究以毛竹Phyllostachys edulis葉片為材料，利用掃描電子顯微鏡的高清成像功能檢測植硅體微觀形態特征，從微觀形態上研究毛竹植硅體的穩定性，建立植硅體穩定性微觀表征方法，為深入開展植硅體碳研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 毛竹植硅體樣品制備

1.1.1 毛竹葉片樣品采集 在野外調查基礎上，采集杭州市臨安區青山鎮毛竹葉片約500 g。樣品帶回實驗室，用軟毛筆輕掃除去表面灰塵和其他雜物，過程中需注意不損傷毛竹葉片樣品。用吹氣球吹凈后，蒸餾水進行清洗。在105℃下殺青20 min，再在75℃下烘24 h以上，磨碎備用。

1.1.2 植硅體提取 采用微波消解法、濕灰化法和干灰化法提取毛竹葉片中植硅體。①微波消解法：稱取毛竹葉片樣品 0.300 0 g，加4.5 mL質量分數為65%的硝酸（HNO3），3.0 mL質量分數為30%的過氧化氫（H2O2），1.0 mL質量分數為36%的鹽酸（HCl），置于微波消解儀中，消解2 h后取出，離心清洗［7］。提取后的植硅體，采用Walkley-Black法［22］確保除去植硅體外殘留的有機碳等物質。65℃烘干24 h。②濕灰化法：取0.100 0 g毛竹葉片樣品，置于100 mL燒杯，加入約10.0 mL質量分數為65%的硝酸（HNO3），于電熱板上緩慢加熱，使樣品內有機質逐漸被氧化，直至有機質氧化完全，樣品不再呈黏稠，溶液澄清為止。再加入2 mL 100 g·kg－1的稀鹽酸清洗，以去除附著的鈣離子；去離子水清洗2次，無水乙醇清洗2次，65℃烘干24 h。③干灰化法：取0.100 0 g毛竹葉片樣品置于500℃的馬弗爐中灰化6 h，取出，再加100 g·kg－1的稀鹽酸清洗，溶解灰分中的鈣離子，離心清洗2次，65℃烘干24 h。。

1.1.3 植硅體溶解度試驗 稱取微波消解法提取的純凈毛竹葉植硅體50 mg，放入50 mL的塑料離心管中，加入0.4 mol·L－1的硼酸緩沖液45.0 mL（pH 10，浸泡用）。搖勻后放置于恒溫振蕩機中，設置溫度為50℃，振動頻率為70 r·min－1，振蕩15 d。抽取搖勻的懸濁液1 mL置于微量離心管中，10 000 r·min－1離心10 min；在含有植硅體的沉淀中加入超純水，10 000 r·min－1清洗10 min，直到清洗干凈。沉淀烘干后備用。

1.2 植硅體掃描電鏡分析前處理

稱取 20 mg已提取的植硅體樣品，分散在100 mL質量分數為7 g·kg－1的甘油中；用定量吸管吸取0.01 mL制樣，紅外線燈烘干。采用離子濺射鍍覆法進行植硅體樣品鍍膜。將上述烘干后的植硅體樣品粉末均勻地撒在卡片紙上，用粘有導電膠的掃描電鏡樣品臺沾取樣品。樣品及樣品臺置于BC-Ⅱ離子濺射儀中進行真空噴鍍,噴鍍時金靶材處于陰極，調整靶材和樣品臺合適的距離，抽真空后通入微量氮氣。兩極間加電場后產生輝光放電，并調節電流大小。重復多次至獲得最佳的鍍膜真空度和電流值。

1.3 電鏡觀察

前處理完成后，放入場發射掃描電子顯微鏡中（型號為SU-8000 Hitachi）；調節燈絲飽和點、光闌對中、光闌合軸、消象散調節和聚焦觀測等，可獲得清晰的表面形貌植硅體微觀表面形貌圖像。

2 結果分析

2.1 3種不同方法提取的植硅體的微觀形態特征

由圖1A可見：微波消解法提取的毛竹植硅體長為12～14 μm，寬為7～10 μm；植硅體呈現長鞍形（竹節形），圖像細節清晰，植硅體形態完整，說明微波消解法是一種獲得植硅體理想形貌的方法。用干灰化法（圖1B）和濕灰化法（圖1C）提取的毛竹植硅體，除長鞍形外，還觀察到啞鈴形；植硅體長為12 μm，連接處寬度為4 μm，兩端的寬度為8 μm；用濕灰化法提取的毛竹植硅體還可見微小突起（圖1C）。

圖1 單個植硅體掃描電子顯微鏡圖片Figure 1 SEM graph of phytolith

由圖1可知：3種提取毛竹植硅體的方法均能獲得清晰的植硅體微觀形態，但相比而言，微波消解法所展現的細節最為豐富、清晰，可以觀察到植硅體表面的溶蝕坑、破碎、粗糙度等微形態變化特征，能保留植硅體的細節形貌不被破壞。因此，微波消解法為最佳提取方法，更有利于探究植硅體的微觀形貌及其穩定性。

2.2 植硅體穩定性的電鏡分析

微波消解法提取的植硅體經pH 10的硼酸緩沖液中浸泡15 d后微觀形態發生變化。從圖2A可以看出：未經浸泡的毛竹植硅體呈現棒狀，沒有彎曲和分叉，表面較為光滑。浸泡15 d后的植硅體（圖2B）樣品表面變粗糙，出現溶蝕坑；內部硅質顆粒暴露，清晰可見其呈聚集分布。由此認為植硅體并非惰性，其不穩定性從外表面開始被破壞；掃描電鏡圖像驗證了 “植硅體有可能不穩定”的結論。

目前對植硅體穩定性的判斷還沒有統一的評價標準，因此如何尋求有效方式快速了解植硅體的穩定性成為研究者急需解決的問題之一。本研究結果認為：掃描電鏡作為一種直觀探測方式，可以觀測到植硅體表面的微形態變化，可為植硅體穩定性的研究提供依據和輔助判別方法。

圖2 微波消解法提取的植硅體浸泡前后的微觀形態變化Figure 2 Micromorphological changes of the phytolith extracted by microwave digestion method before and after soaking

3 結論

微波消解法是提取毛竹植硅體比較理想的方法，可以觀察到植硅體表面的溶蝕坑、破碎、粗糙度等微形態變化特征。對微波消解法提取的毛竹植硅體，經pH 10的硼酸緩沖液中浸泡15 d后進行掃描電鏡觀測，能觀察到毛竹植硅體在浸泡后的不穩定狀態，驗證了 “植硅體不穩定”的說法。