高效液相色譜-氫化物原子熒光聯(lián)用技術(shù)分析富硒苦蕎中的硒形態(tài)

李瑤佳

(西昌學(xué)院 農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615013)

硒(Selenium)是人體必需的微量元素，它具有提高人體免疫力、預(yù)防大骨節(jié)病、預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗氧化等多種生理功能[1]。在自然界和植物中硒有多種存在形態(tài)，無機硒形態(tài)主要有硒酸鹽Se(Ⅵ)和亞硒酸Se(Ⅳ)，這兩種硒形態(tài)毒性較大，不能被人體吸收利用。有機硒形態(tài)主要有硒代半胱氨酸(Se-Cys)、硒代蛋氨酸(Se-Met)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)等十余種[2]。據(jù)調(diào)查，我國一半以上的地區(qū)屬于缺硒地帶[3]，僅靠天然食物中的硒不足以滿足人體的正常需要[4]。植物能夠?qū)θ梭w有害的無機硒轉(zhuǎn)化為機硒，是人體獲得有機硒的重要來源。所以對植株噴施硒肥，通過植株將無機硒轉(zhuǎn)化成可被人體吸收利用的有機硒，提高天然食物中的硒含量，幫助生活在缺硒地區(qū)的人們科學(xué)的補硒，預(yù)防疾病，具有重要意義。

目前，關(guān)于植物中硒形態(tài)的分析方法主要有：高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ICP-MS)、高效液相色譜-電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ICP-AES)、高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光聯(lián)用技術(shù)(HPLC-HG-AFS)、高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ESI-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)等[5-7]。其中HPLC-HG-AFS聯(lián)用技術(shù)，由于其光譜簡單，選擇性好，使用成本低，檢測靈敏度高是植物中硒形態(tài)檢測的常用方法[8]。本文以涼山州布拖縣富硒栽培的苦蕎為原料，采用蛋白酶水解的方法提取苦蕎葉莖籽中的硒形態(tài)，然后采用HPLC-HG-AFS聯(lián)用技術(shù)對富硒苦蕎中硒形態(tài)進行檢測，了解苦蕎植株將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒的硒形態(tài)和轉(zhuǎn)化率，從而評價富硒苦蕎的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

富硒苦蕎樣品采集于四川省涼山州布拖縣。樣品依次用自來水和超純水洗凈，60℃干燥粉碎，莖葉籽過60目篩，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1000 μg/mL Se(Ⅳ)標準溶液：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；Se(Ⅵ)標準溶液，Se-Cys標準品，Se-Met標準品：北京百靈威公司；蛋白酶K：Sigma公司；鹽酸(HCl)，硼氫化鉀(KBH4)，氫氧化鈉，氨水均為分析純：成都科龍化工試劑廠；磷酸二氫銨(NH4H2PO4)為色譜純：天津市光復(fù)精細化工研究所；所有實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1.2.1 試驗儀器

LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津儀器公司；PRP-X100陰離子色譜柱(10 μm，4.1×250 mm)：瑞士Hamilton公司；AFS-930雙道原子熒光光度計：北京吉天儀器公司，Centrifuge 5804R冷凍離心機：德國Eppendorf公司，SG3200HPT超聲波清洗器：上海冠特超聲儀器有限公司。

1.2.2 儀器條件和色譜條件

儀器條件選擇：負高壓，270V；燈電流，80 mA；載氣流量，500 L/min；屏蔽氣流量：1000 L/min；原子化器高度，7 mm；原子化器溫度，300℃；紫外燈，15 W(2根)；A泵速，60 r/min；B泵速，70 r/min。

色譜條件選擇：選用Hamilton10 μm PRP-X100陰離子色譜柱(4.1×250mm)，通過優(yōu)化HCl體積分數(shù)、KBH4質(zhì)量濃度、NH4H2PO4濃度、NH4H2PO4流動相的pH值，使4種硒形態(tài)有效分離。

1.3 方法

1.3.1 硒標準溶液的配制

準確稱取一定質(zhì)量的硒形態(tài)標準品，用超純水配制成濃度為10 mg/L的Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)儲備液、1 mg/L的Se-Cys和Se-Met儲備液,使用時用超純水稀釋至一定濃度。

1.3.2 樣品預(yù)處理

分別稱取1.000 g苦蕎葉莖籽的樣品于25 mL錐形瓶中，加入10 mL Tris-HCl(pH值=7.5，30 mmol)，超聲提取30min，加入20 mg蛋白酶K，37℃恒溫攪拌24 h。酶解結(jié)束后，4℃10000 r/min 超速冷凍離心20min，得到酶解提取液。

1.3.3 硒含量測定和硒形態(tài)分析

準確稱取苦蕎葉莖籽樣品0.5000 g，酶解提取液1 mL和提取殘渣0.2000 g，分別加入5 mL，體積比為4∶1的HNO3和HClO4的混合酸，放置過夜；次日，在溫度為160℃的電熱板上消解，當(dāng)溶液剩余2 mL左右時，取下冷卻至室溫，再加入5 mL體積分數(shù)為50%的HCl，在水浴鍋中進行還原，反應(yīng)至溶液體積剩余2 mL左右取下，定量轉(zhuǎn)移至10 mL比色管中，加入1 mL 100 g/L鐵氰化鉀溶液和2 mL濃HCl，用超純水定容至刻度，隨帶一個試劑空白。用于隨后的硒含量測定。取酶解提取液，用過濾分子量為3 KDa的超濾離心管，10000 r/min冷凍離心30min，超純水定容至10 mL，HPLC-HG-AFS聯(lián)用技術(shù)對各種硒形態(tài)進行分離和測定，結(jié)果以過濾液中硒含量表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 測試條件的選擇

由于KBH4和HCl反應(yīng)生成的活性氫，只能與Se(Ⅳ)生成氣態(tài)硒化氫(H2Se)被原子熒光檢測器檢測[9]。因此，試驗采用在氫化物發(fā)生前加載紫外燈消解的方法實現(xiàn)Se-Cys和Se-Met的在線消解以及Se(Ⅵ)的還原，并對氫化物發(fā)生條件和色譜分離條件進行了優(yōu)化。

2.1.1 HCl體積分數(shù)的選擇

試驗了HCl體積分數(shù)在10%～50%范圍內(nèi)對四種硒形態(tài)標準溶液熒光強度的影響(圖1)。當(dāng)HCl體積分數(shù)低于30%時，四種硒形態(tài)的熒光強度隨著HCl的體積分數(shù)的增加而增加，當(dāng)HCl體積分數(shù)為30%時，四種硒形態(tài)的熒光強度最大。隨著HCl體積分數(shù)的繼續(xù)增加，四種硒形態(tài)的熒光強度緩慢下降。選擇體積分數(shù)為30%的HCl作為載流。

圖1 HCl體積分數(shù)對硒形態(tài)熒光強度的影響

2.1.2 KBH4質(zhì)量濃度的選擇

試驗了質(zhì)量濃度為12～28 g/L的KBH4作為還原劑對四種硒形態(tài)標準溶液熒光強度的影響(圖2)。當(dāng)KBH4的質(zhì)量濃度低于20 g/L時，四種硒形態(tài)的熒光強度隨著KBH4質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)KBH4質(zhì)量濃度為20 g/L時，四種硒形態(tài)的熒光強度達到最大。繼續(xù)增加KBH4的質(zhì)量濃度，四種硒形態(tài)熒光強度變化不大。KBH4質(zhì)量濃度太低，硒形態(tài)不能被充分還原成H2Se氣體，氫化物發(fā)生效率低；質(zhì)量濃度太高，會生成過量氫氣稀釋H2Se的濃度，氫化物發(fā)生效率也會降低。選擇質(zhì)量濃度為20 g/L的KBH4作為還原劑。

圖2 KBH4質(zhì)量濃度對硒形態(tài)熒光強度的影響

2.1.3 NH4H2PO4濃度的選擇

在陰離子色譜柱分離過程中，常用的流動相有Tris-HCl緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液和NH4H2PO4緩沖液[10]。試驗選擇NH4H2PO4作為流動相，考察了NH4H2PO4濃度為40～100 mmol/L范圍內(nèi)四種硒形態(tài)的分離效果(圖3)。NH4H2PO4濃度太低，導(dǎo)致洗脫時間太長，并且Se-Cys和Se-Met的峰型拖尾嚴重，這兩種硒形態(tài)不能有效分離。NH4H2PO4濃度太高，Se-Cys與Se(Ⅳ)的保留時間會有重疊，當(dāng)NH4H2PO4濃度為60 mmol/L時四種硒形態(tài)能夠有效的分離。選擇濃度為60 mmol/L的NH4H2PO4作為流動相。

圖3 NH4H2PO4濃度對硒形態(tài)保留時間的影響

2.1.4 NH4H2PO4流動相的pH值選擇

圖4 NH4H2PO4流動相的pH值對硒形態(tài)保留時間的影響

以濃度為60 mmol/L的NH4H2PO4作為流動相，氨水調(diào)節(jié)pH值，考察pH值在5.6～6.4范圍內(nèi)四種硒形態(tài)的分離效果(圖4)。流動相pH值太低和太高都會導(dǎo)致SeCys和Se(Ⅳ)的保留時間重疊，不能有效分離，當(dāng)pH值為6.0時四種硒形態(tài)能夠有效的分離。選擇pH值為6.0的NH4H2PO4作為流動相。

2.2 標準曲線和檢出限

分別配制Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)濃度為0、50、100、200、300、400 μg/L及Se-Cys濃度為0、300、500、1000、2000、3000 μg/L和Se-Met濃度為0、500、1000、2000、3000、4000 μg/L的混合標準工作液。在優(yōu)化的分離檢測條件下進行測定并繪制標準曲線。連續(xù)測定11個試劑空白，以測定值標準偏差的3倍對應(yīng)濃度作為方法的檢出限(D=3S/K)。線性方程、檢出限和四種硒形態(tài)標準色譜圖見表1和圖5。

表1 線性方程和檢出限

1-Se(Ⅳ)；2-Se-Cys；3-Se-Met；4-Se(Ⅵ)圖5 四種硒形態(tài)標準色譜圖

2.3 樣品的測定

采用HPLC-HG-AFS聯(lián)用技術(shù)對富硒苦蕎葉莖籽中的硒形態(tài)進行分析，葉莖籽中硒形態(tài)的色譜圖分別見圖6、圖7和圖8，硒形態(tài)含量見表2。富硒苦蕎籽的提取液中硒形態(tài)的種類是Se-Met和Se(Ⅳ)，分別占籽粒總硒量的33.10%和2.90%。富硒苦蕎葉的提取液中硒形態(tài)的種類是Se(Ⅳ)，占葉總硒量的1.84%。富硒苦蕎莖的提取液中未檢出硒形態(tài)。上述結(jié)果表明，在富硒苦蕎的籽中硒主要是與蛋氨酸結(jié)合形態(tài)存在，葉和莖中的硒化合物大部分都是無機硒，不能被蛋白酶水解，或與分子量大于3 KDa的化合物相結(jié)合，被超濾膜過濾了。苦蕎葉中除了含有豐富的蛋白質(zhì)，還含有脂肪酸、多糖、黃酮以及纖維素等大分子化合物[11]。所以硒可能與這些大分子化合物結(jié)合留在了殘渣中。

圖6 富硒苦蕎籽的色譜圖

圖7 富硒苦蕎葉的色譜圖

表2 樣品分析結(jié)果(x±s,n=3)

注：ND表示低于檢出限，未檢出。

3 結(jié)論

本文采用高效液相色譜-氫化物原子熒光(HPLC-HG-AFS)聯(lián)用技術(shù)對富硒苦蕎中的Se(Ⅳ)、Se-Cys、Se-Met和Se(Ⅵ)四種硒形態(tài)進行了分離和檢測。對色譜分離條件和氫化物發(fā)生條件進行了考察，確定了HCl、KBH4、NH4H2PO4的最佳用量以及色譜分離的最佳pH值，為富硒苦蕎中硒形態(tài)的分析提供可靠的檢測方法。