振蕩提取-高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法測定藻類中6種形態砷化合物

周志豪，黃振華，周朝生，陸榮茂，曾國權，陳星星

(浙江省海洋水產養殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，浙江 溫州 325005)

砷是一種普遍存在于藻類中主要的有害重金屬元素之一，其毒性不僅與元素總量有關，還與其存在的化學形態密切相關[1]。As的化學形態包括高毒性的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)，低毒性的甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)和基本無毒的三甲基砷酸(TMA)、砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)和砷糖(AsS)。目前，對砷的形態分析主要集中在中藥材、香菇，而藻類中As的相關研究主要集中在對其總量的測定，對于其形態分析研究較少。為對藻類樣品中As的不同形態進行有效的分離測定，合適的分離手段和檢測方法必不可少。HPLC具有分離高沸點、難揮發性的物質的優點，而且能設置不同分離程序；電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)具有靈敏度高、動態范圍寬、干擾少、可連續測定等優點。因此，采用HPLC與ICP-MS聯用技術建立同時快速檢測藻類各形態As的分析方法，旨在為藻類中As的形態分析及其安全性評價提供參考[2-4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2016年9月～2016年12月間，在浙江蒼南、洞頭、平陽、瑞安、舟山六橫蒼洞、三門、臨海、溫嶺采集了6個羊棲菜、9個海帶、19個紫菜， 這3個品種共34個藻類樣品。

AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ(含量分別為(28.0±1.1)、(38.8±1.1)、(75.7±1.2)、(52.9±1.8)、(25.1±0.8)、(17.5±0.4)μg ·g-1)國家計量科學研究院；磷酸二氫銨(優級純)；雙氧水(優級純)；硝酸(優級純)

1.2 儀器與設備

采用安捷倫7900電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)測定As；采用安捷倫1260HPLC和7900電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)聯用測定砷的形態；ETHOS UP密閉微波消解儀(意大利Milestone公司)。

1.3 方法

1.3.1 HPLC-ICP-MS條件

HPLC條件：Hamilton PRPX-100陰離子交換柱(250 mm×4.1 mm,10 μm)；流動相A：水，流動相B：25 mmol/L磷酸二氫銨溶液(以氨水調節pH值至8.0)；梯度洗脫程序：0～15min，100%A～100%B，15～20min，100%B～100%A；20～25min，100%A；流速1.0 mL/min；進樣量50 μL。

1.3.2 樣品前處理

用采樣點海水清洗去除海藻表面附著物。4 ℃下運回實驗室。超純水沖洗數次，60 ℃烘干至恒重。磨碎，過60目篩于-20 ℃，密封避光保存待測[1,5]。分析過程以國家生物成分分析標準物質GBW10023(紫菜)進行質量控制。

1.3.3 總砷含量的測定

準確稱取藻類樣品1.000 g(精確到0.0001 g)于微波消解管中，加入6 mL優級純硝酸，2 mL優級純過氧化氫，采用微波消解儀消化至溶液澄清透明，消解程序見表1。消解程序結束后，待其冷卻，取出消解管，于160 ℃趕酸至近干，用體積分數2 %硝酸定容至10 mL，過0.22μm濾膜，同時做樣品空白，配制標準曲線溶液，用ICP-MS儀檢測樣品中總砷的含量。

1.3.4 提取方式的選擇

設計了機械振蕩裝置，并研究了不同的振蕩頻率、振蕩時間(180～360min)對6種形態砷化物的提取。

1.3.5 藻類樣品中6種形態砷化合物的提取

準確稱取2.0000 g(精確到0.0001 g)藻類樣品于50 mL離心管中，加入30 mL 0.3 mol/L乙酸溶液提取，將藻類樣品混合均勻后進行振蕩提取，10000 r/min離心10min，收集上清液，將沉淀重復提取2次，合并上清液，將上清液于1 0000 r/min離心10min后過0.22 μm濾膜，40 ℃條件下濃縮至近干，用超純水定容至10 mL，過0.22 μm濾膜進行HPLC-ICP-MS分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

樣品中的AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ等砷形態化合物，會由于溶液中的不同的pH值而呈現不同的電性，從而影響其在柱子上的保留時間，本實驗采用了Hamilton PRPX-100(250 mm×4.1 mm,10 μm)陰離子交換柱對不同形態的As進行分離實驗。選取了碳酸銨溶液、磷酸鹽緩沖液及磷酸二氫銨溶液3種流動相進行分離。結果表明，AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ這6種形態砷在磷酸二氫銨溶液作用下，分離時間較短，峰形較佳；而在流動相磷酸鹽緩沖液和碳酸銨溶液作用下，6種砷形態化合物并不能完全分離，AsC和AsB無法分開。另外實驗還考察了磷酸二氫銨濃度對6種形態砷保留時間的影響，分別采用15、20、25、30和35 mmol/L，5種不同濃度的磷酸二氫銨溶液，對6種形態As的混標溶液進行梯度洗脫，結果如圖1所示。由圖1可知，當磷酸二氫銨濃度增大時，各形態As的保留時間表現各不相同，AsⅤ的保留時間快速的減少，DMA、MMA的保留時間緩慢的減少，AsC、AsB、AsⅢ的保留時間并沒有太大變化，這表明磷酸二氫銨濃度增大時，對不同形態的砷洗脫能力并不完全相同；當磷酸二氫銨濃度達到25 mmol/L時，20min內6種形態的As達到基線分離，峰形較佳，已能完全滿足測試要求，當度大于25 mmol/L時部分形態As的色譜峰開始出現重疊，而且流動相濃度過大，易在柱子內沉積堵塞，因此本實驗采用25 mmol/L磷酸二氫銨為流動相[7]。

pH值對不同形態As的分離有較大的影響，實驗考察了pH值對其保留時間的影響，結果發現：pH值在5.0～10.0范圍時，6種形態的As可以較好地分離開，由于pH值增大有利于縮短分離時間，因此為了保證分離度的同時縮短分析時間，本實驗選擇pH值8.0。

圖1 磷酸二氫銨濃度對6種形態As的色譜保留時間的影響

圖2 磷酸二氫銨pH值對6種形態As的色譜峰保留時間的影響

2.2 提取劑的優化

對于多形態砷提取劑相關報道，常見的提取溶劑有水、低濃度酸、甲醇水等體系。本實驗比較了不同提取溶劑的萃取效率，在實驗中，發現采用甲醇/水(體積比1∶1)振蕩提取時，各形態As的總提取效率有時會高達130%。這可能是因為甲醇溶劑提高了As的離子化效率，從而增強了As的信號值。另外采用甲醇溶劑會使得實際樣品的提取液與標準溶液pH值存在差異，也就使得保留時間產生偏移，但是乙酸作為提取劑可以有效地避免這一現象。

2.3 提取方式的選擇

振蕩提取裝置是實驗室自我設計的裝置，如圖3所示。

13a1：提取管；13b：提取管配件；13a2提取管密封蓋；12a：第一夾頭；12b：第二夾頭；12c：懸置部圖3 振蕩提取裝置

經過實驗測試，發現振蕩頻率在200 r/min；時間設置在200min，對藻類中砷的提取較完全。

2.4 方法線性范圍與檢出限

分別配制1、2、5、10、20、50 μg/L的系列砷形態混合標準溶液，在優化的HPLC條件下進行分析，得到標準曲線，如表1所示，6種形態的砷化合物的相關系數R2均大于0.9980。在優化的HPLC工作條件下，采用逐級稀釋法以3倍信噪比測定檢出限，AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA和AsⅤ的檢出限分別為0.26、0.27、0.0.34、0.29、0.24、0.31 μg/L。

表1 6種砷化合物的標準曲線、檢出限及精密度

2.5 方法的精密度

為考察方法的精密度，選擇50 μg/L的6種砷形態的混合標樣連續測定6次，按優化的實驗條件進行分析，以相對標準偏差評價其重復性，如表1所示，6種形態砷化合物的相對標準偏差為1.6%～3.9%，均小于5%。

2.6 加標回收率

選擇藻類樣品進行研究，選擇提取效果最好的0.3 mol/L乙酸溶液進行振蕩提取，分別向其中加入低、中、高3種濃度的6種砷形態混合標準溶液，按優化的實驗條件進行測定，如表所示。AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA和AsⅤ的加標回收率分別為92.5%～96.35%、94.2%～98.2%、89.1%～93.1%、85.1%～90.1%、92.1%～98.3%、88.1%～93.4%。

2.7 樣品測定

AsC為砷膽堿、AsB為砷甜菜堿、AsⅢ為三價砷、DMA為二甲基砷、MMA為一甲基砷、AsⅤ為五價砷

圖4 藻類樣品的HPLC-ICP-MS色譜圖

樣品經過0.3 mol·L-1乙酸溶液振蕩提取，如圖1所示，發現羊棲菜砷的種類較多，在砷甜菜堿和五價砷之間有三個未知峰；其次是海帶，除了一個三價峰以外，也有三個未知峰；紫菜中砷的種類較少，一個三價峰和一個未知峰，從圖中還可以發現紫菜中有機砷占總砷比例比羊棲菜和海帶都要大。

3 討論

本研究發現在優化色譜條件時，AsC、AsB和 As(Ⅲ)并沒有隨著我們對流動相濃度改變，出峰時間而發生變化，因為在梯度洗脫程序：0～20min，100%A～100%B，而最晚出峰的As(Ⅲ)也僅2.6min，因此流動相溶液大部分為水溶液，而水溶液中，As(Ⅲ)、As(V)、DMA和MMA是以陰離子形式存在，而AsB和AsC是以陽離子形式存在[6]。因此，對于陰離子交換柱，在以磷酸二氫銨為流動相條件下，As(Ⅲ)、As(V)、DMA、MMA和色譜柱固定相上的離子交換劑基團相互作用，二甲基砷以HA和A-各占一半的形式存在，因此在陰離子色譜柱上有一定保留；一甲基砷完全以HA-的形式存在，因此在陰離子色譜柱上保留強于二甲基，而As(V)部分已經以HA2-的形式存在，是這幾種離子中保留最強的，按照作用力的大小，As(Ⅲ)、DMA、MMA和As(V)依次被洗脫出來[8]。而AsC和AsB無法與離子交換劑的交換中心發生交換，只能隨著流動相先流出，因此當As(Ⅲ)、As(V)、DMA、MMA、AsC和AsB同時存在時，總是AsC和AsB最先出峰[7-9]。

萃取溶劑的選擇。在研究樣品提取溶劑時，剛開始考慮甲醇水作為提取溶劑，但我們發現甲醇水比例較難把握，較少對樣品提取效率不高，多了甲醇具有弱變形性質，反而降低了提取效率，這可能是甲醇含量多了，提取出樣品中有機物質，從而干擾了測定的精確性，并且要甲醇的增敏效應，必然在前處理中增加相應的操作步驟，給實驗操作者帶來一定勞動強度。其二，甲醇屬于無色易揮發的液體，具有一定的毒性，對實驗操作者身體健康有潛在的危害。其三，乙酸在作為提取溶劑時，與標準溶液在pH值上保持了一致，避免了樣品峰的偏移，并且能有效的提取樣品中的多形態砷[10-11]。

4 結論

建立了AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA和AsⅤ6種形態As的HPLC-ICP-MS方法。6種不同形態的As的HPLC-ICP-MS方法。6種不同形態的As在20min內實現了基線分離。藻類中的As含量較低，且大部分以低毒的砷糖形式存在。振蕩溶劑提取能同時將有機As和無機As提取出來，較客觀地反映樣品中As的形態分布。對于藻類樣品中As的安全性評價而言，其形態分析比總量檢測更為合理。本方法準確、可靠，可為藻類中As的形態分析及安全性評價提供參考。