ClO2殺菌復合殼寡糖涂膜對鮮食糯玉米的保鮮效果

龔魁杰，陳利容，祁國棟，李曉月，孫琳琳，劉開昌*

（山東省農業科學院作物研究所，山東 濟南 250100）

鮮食糯玉米的食用品質主要表現為糯性、甜味和柔嫩性，其中柔嫩度是鮮食糯玉米品質育種與采后貯藏的關鍵指標[1-3]。鮮食糯玉米采后貯藏期間極易出現柔嫩度下降、食用品質劣化現象[4-5]，其主要是由于貯藏過程中的微生物侵染導致抗性誘導作用增強，使抵御微生物侵染的次生代謝反應苯丙烷代謝增強，增加木質素等植保素的積累[6-7]。很多化學、物理、生物因子被用來抑制微生物侵染，降低抗性誘導效應，延緩木質素積累[7-11]。鮮食糯玉米采后抑菌研究還不多見，Pitak等[12]制備了香蕉粉/殼聚糖膜以保鮮幼嫩玉米，增強果穗的抑菌能力，但相關研究仍需要加強。

ClO2是一種安全、無毒的綠色消毒劑，作為高效的果蔬保鮮劑近年來受到普遍關注[11,13-14]。Yang Huqing等[11]發現采用28 mg/L的ClO2浸泡處理竹筍，可以抑制病原菌侵染，降低竹筍質量損失，延緩木質素積累。殼寡糖（chitosan oligosaccharide，COS）現已被廣泛用于誘導植物的防衛反應，如可促進活性氧迸發、植保素形成和病程相關蛋白積累等[15]。Wang Fengde等[16]發現COS作為激發子可以誘導對多種病原菌的抗性，誘導苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）mRNA積累，激發過氧化物酶（peroxidase，POD）活力，促進多酚合成；Ma Lin等[17]發現5 mg/mL COS處理能夠延緩杏李質地下降，減少乙烯釋放，降低果實腐敗率等。COS多與其他多糖或殺菌劑聯合應用，可增強其抗性誘導作用[11,16]。因此，本實驗在前人研究結果基礎上，采用ClO2殺菌復合COS涂膜的方法處理鮮食糯玉米果穗，并進行低溫氣調貯藏，以降低果穗的微生物侵染情況；實驗分析了貯藏不同時期木質素、多酚含量，以及PAL、POD活力變化，以探討鮮食糯玉米采后抵御病原菌侵染、保持柔嫩質地的方法及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯玉米（Zea mays L.）品種為‘京科糯2000’，山東省農業科學院作物研究所實驗場種植。授粉后第24天采收，為保證所取果穗的一致性，采收時選擇生長發育一致的植株。

1.2 儀器與設備

UV2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；DK-2000恒溫水浴振蕩器 天津市泰斯特儀器公司；SW-CJ-2FD凈化工作臺 江蘇蘇州凈化設備公司；160HL恒溫恒濕培養箱 江蘇金怡儀器科技公司；LDZX-50FBS立式蒸汽壓力滅菌器 上海申安醫療器械廠；Scientz-192動植物組織研磨器 浙江寧波新芝生物科技股份公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

每處理取30 個果穗，采用不同處理方式后，裝入規格為60 cm×60 cm的氣調貯藏袋中，每袋30 個果穗，整齊排列好，貯藏于（4±1）℃、相對濕度85%條件的恒溫庫中，貯藏期間每7 d定時取5 個果穗的中部籽粒混勻，分為兩部分，一部分直接測定多酚、木質素含量，另一部分用液氮速凍，—40 ℃保存，用于進行酶活力分析。

鮮食糯玉米果穗去除苞葉后，采用去離子水清洗去除表面花絲等雜質，實驗分為4 組，每組取30 個果穗，經不同處理后自然晾干、裝入氣調包裝袋中。對照組：去離子水清洗；ClO2殺菌處理組：置于200 mg/L ClO2溶液中浸泡10 min；COS涂膜處理組：于15 mg/mL COS溶液中浸泡5 min；ClO2-COS處理組：于200 mg/L ClO2溶液中浸泡10 min，自然晾干后于15 mg/mL COS溶液中浸泡5 min。實驗設2 次重復，結果取2 次重復的平均值。

1.3.2 微生物菌落計數方法

參考GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》[18]測定霉菌和酵母菌總數。

1.3.3 木質素含量的測定

按照Gong Kuijie等[5]的方法測定木質素含量，結果以鮮質量計。木質素積累速率按式（1）計算。

其中：wn為第n天取樣時的木質素含量/（mg/g）；wn+7為第n+7天取樣時的木質素含量/（mg/g）。

1.3.4 多酚含量的測定

多酚含量的測定參照Ti Huihui等[19]的方法略加修改。準確稱取0.6 g鮮玉米籽粒，加入液氮脆化，在液氮揮發的同時搗碎成粉末狀。按固液比1∶15（m/V）加入體積分數80%乙醇溶液溶解后，置于水溫為40 ℃的超聲清洗器中，在200 W功率下超聲45 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液3 mL，稀釋兩倍。準確吸取樣品溶液2 mL于10 mL容量瓶中，分別加入蒸餾水5 mL、Folin-Ciocalteu試劑0.5 mL和75 g/L的Na2CO3溶液1.5 mL，加水稀釋至刻度，混勻，75 ℃水浴10 min，冷卻至室溫，在760 nm波長處測定吸光度。稱取50 mg的沒食子酸標準品，按照樣品測定方法制作標準曲線。按照標準曲線計算吸光度平均值對應的質量濃度。鮮食糯玉米中多酚含量按公式（2）計算，結果以鮮質量計。

式中：ρ為按照標準曲線計算的質量濃度/（μg/mL）；V為提取液的總體積/mL；m為樣品質量/g。

1.3.5 酶液提取及PAL、POD活力測定

按照Gong Kuijie等[5]的方法進行酶液提取并測定PAL、POD活力，每分鐘吸光度變化0.01為一個酶活力，結果以鮮質量計。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 不同處理對鮮食糯玉米貯藏過程中霉菌和酵母菌數的影響

表1 不同處理對鮮食糯玉米貯藏過程中霉菌和酵母菌總數的影響Table1 Effects of different treatments on total mold and yeast count of fresh waxy corn during storage

鮮食糯玉米采后貯藏過程中，微生物侵染是導致其貨架期縮短的重要因素[20]。從表1中可以看出，隨貯藏時間延長，病原菌侵染明顯加重，其中對照組在貯藏末期時霉菌和酵母菌總數大幅度上升，達（4.30±0.21）（lg（CFU/g）），顯著高于單純ClO2殺菌處理組和ClO2-COS處理組，但與COS涂膜處理組不存在顯著差異。ClO2-COS處理組表現出了良好的抑菌能力，貯藏35 d時霉菌和酵母菌菌落總數為（2.30±0.12）（lg（CFU/g）），顯著低于ClO2殺菌處理組（（3.78±0.16）（lg（CFU/g）））和COS涂膜處理組（（4.18±0.09）（lg（CFU/g）））（P＜0.05）。從圖1中也可以看出，ClO2-COS處理組無肉眼可見菌斑，而對照組和COS涂膜處理組菌斑最為明顯，ClO2殺菌處理組也有少量菌斑出現。ClO2殺菌處理組和COS涂膜處理組都表現了一定的抑菌能力，但可能由于取樣間隔較長，7、14 d時與對照組的霉菌和酵母菌總數不存在顯著性差異（P＞0.05），僅在21 d時出現顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 不同處理組鮮食糯玉米貯藏末期果穗染菌情況Fig.1 Microbial infection of fresh waxy corn at the end of storage in different treatment groups

2.2 不同處理對鮮食糯玉米貯藏過程中木質素含量的影響

植物在不同逆境環境生存進化中獲得了一系列防衛反應系統，病原菌侵染后的木質素積累就是植物細胞應對外界的一個重要防御措施[7,21]。但是，木質素積累同時又會造成果實硬度增大，大多數研究認為果實質地劣化主要原因在于采收傷害、微生物侵染造成了木質化[9,21-22]。因此，如何恰當地調控抗病防御與質地劣化之間的關系成為保鮮貯藏技術的重點。

圖2 不同處理對鮮食糯玉米采后貯藏期間木質素含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on lignin contents of fresh waxy corn during storage

從圖2中可以看出，不同采后處理的鮮食糯玉米貯藏期間木質素含量總體上隨貯藏時間延長而增加，表明采后衰老和微生物侵染會造成鮮食糯玉米籽粒中的木質素積累。對照組的木質素含量在貯藏期間持續升高，從采收初期的（27.69±1.21）mg/g上升至貯藏末期的（33.49±0.87）mg/g，并且始終高于其他處理組，表明不采用保鮮措施會快速啟動防御機制，同時采后衰老也未得到有效抑制[11]，造成木質素大量生成，這也造成了質地的快速劣化。對表1和圖1、2中對照組各指標分析可以發現，木質素大量積累并不會增加鮮食糯玉米果穗的抗病原菌侵染能力。

與對照組相反，單純ClO2或COS處理的果穗木質素含量則一直處于較低水平，二者木質素含量無顯著差異（P＞0.05），表明COS或ClO2處理均能適當降低木質素積累。結合表1和圖1、2可以發現，在木質素積累較少的情況下，兩個處理均表現了高于對照的抑菌能力。分析ClO2和COS處理組的木質素積累速率（圖3）可以看出，二者表現出了相近的木質素積累能力。

圖3 不同處理對鮮食糯玉米采后貯藏期間木質素積累速率的影響Fig.3 Effects of different treatments on lignin accumulation rate of fresh waxy corn during storage

ClO2-COS處理組的木質素含量在3 個處理組中最低，在21 d后基本保持穩定（圖2），而其良好的抑菌能力（圖1、表1）進一步表明木質素積累并不能保證抗病原菌侵染能力的提升。分析木質素積累速率的規律也可以發現，ClO2-COS處理組的木質素積累速率隨貯藏時間延長而下降，而對照組積累速率除7～14 d下降外，14～35 d都呈上升趨勢（圖3）；表明ClO2-COS處理在有效抑制微生物侵染的同時，能夠延緩木質素快速積累，從而保持品質穩定。

2.3 不同處理對鮮食糯玉米貯藏過程中多酚含量的影響

圖4 不同處理對鮮食糯玉米采后貯藏期間多酚含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on polyphenol contents of fresh waxy corn during storage

多酚是苯丙烷代謝木質素合成途徑的底物，通常被認為是木質素合成的前體物質[23-24]。多酚含量的變化在一定程度上可以表征木質素合成的變化。從圖4可以看出，ClO2殺菌、COS涂膜以及二者復合處理均顯著降低了貯藏期間多酚含量（P＜0.05）。3 個處理組在35 d貯藏期內，多酚含量均先逐漸下降，28 d后開始上升。0～7 d貯藏期內，ClO2殺菌處理組多酚含量降低幅度最大，由初期的（329.36±0.77）μg/g降低至（262.39±0.39）μg/g；COS處理組多酚含量降低幅度最小，7 d時多酚含量為（327.66±8.97）μg/g，與采收0 d時無顯著差異（P＞0.05）；ClO2-COS處理組多酚含量則處于二者之間，為（294.50±18.28）μg/g。而對照組的多酚含量除前7 d下降外，貯藏期間持續上升，且均高于3 個處理組。結合木質素含量變化可以看出，對照組在貯藏期間一直處于旺盛的多酚-木質素合成代謝狀態，而3 種處理方式則保持了較低的多酚-木質素合成代謝，因而多酚含量變化較為緩慢。旺盛的多酚-木質素合成是以苯丙烷途徑代謝底物苯丙氨酸的消耗為代價的[25]，由此也會導致鮮食糯玉米品質的下降。對比ClO2殺菌、COS涂膜和復合處理的抑菌作用、木質素含量變化和多酚含量變化可以發現，鮮食糯玉米果穗的多酚-木質素合成狀態并不是越低越好，合理地調控木質素合成速率更為重要。

2.4 不同處理對鮮食糯玉米貯藏過程中PAL活力變化的影響

圖5 不同處理對鮮食糯玉米采后貯藏期間PAL活力的影響Fig.5 Effects of different treatments on PAL activity of fresh waxy corn during storage

PAL催化苯丙氨酸轉化為肉桂酸，是導致植物細胞壁木質素沉積的第一關鍵酶[23,26]。鮮食糯玉米采后木質化過程中，PAL活力的變化將會直接影響多酚合成進程。從圖5可以發現，貯藏期間，鮮食糯玉米處理組的PAL活力基本呈先上升后下降再上升的趨勢，對照組的PAL活力明顯比3 個處理組表現出更快、更顯著的變化特征。對照組的PAL活力在0～7 d內下降，之后快速上升，21 d時達到最高，之后快速下降；而3 個處理組的PAL活力先在第7天達到峰值，之后開始下降，均在21 d時達到最低，之后開始上升。相對來講，ClO2殺菌處理對PAL活力的變化趨勢影響更為顯著，而COS涂膜處理和ClO2-COS處理對PAL活力的變化趨勢影響相對要小。

鮮食糯玉米采后由植株向果穗的物質轉運終止，代謝底物來自于采收前積累產物，采收所造成的愈傷作用會導致苯丙烷代謝增強，因此出現PAL活力增強現象[21,27]；隨著果穗對于貯藏環境的適應，冷藏環境降低了呼吸消耗，采取保鮮處理措施的果穗都具有一定的抵御微生物侵染的能力，因此PAL活力出現下降；而隨著貯藏時間的延長，微生物侵染增強，苯丙烷代謝隨之被誘導，PAL活力開始增強；而在微生物侵染過度狀態下，PAL代謝底物被大量消耗，因而其活力開始下降。

對照組的PAL活力在短暫降低后，快速上升趨勢較為明顯，表明只采用去離子水清洗處理的鮮食糯玉米苯丙烷代謝途徑較為旺盛，由于微生物侵染加劇，植物體的抗病響應強烈。對照組貯藏21 d后PAL活力持續下降，也表明代謝底物快速消耗，抗病能力已經基本喪失。與對照組相比，3 個處理組的PAL活力變化均相對平緩，結合3 種處理的抑菌效果可以發現，3 種處理均能適度降低苯丙烷代謝水平，不會造成強烈的抗性誘導響應。與ClO2殺菌處理組的PAL活力在28 d后開始下降對比，COS涂膜處理組和ClO2-COS處理組的PAL活力在28 d后仍在升高，表明COS誘導抗性更有利于延遲代謝底物消耗，抑制病原菌侵染。

2.5 不同處理對鮮食糯玉米貯藏過程中POD活力變化的影響

圖6 不同處理對鮮食糯玉米采后貯藏期間POD活力的影響Fig.6 Effects of different treatments on POD activity of fresh waxy corn during storage

POD在苯丙烷代謝中催化肉桂醇形成木質素的最后一步反應過程，使木質素單體聚合反應合成木質素[26,28]。由圖6可知，鮮食糯玉米采收初期POD活力高于采后貯藏過程任一階段，這可能是由于鮮食糯玉米采前處于旺盛的木質素合成階段，已經積累了大量的木質素單體[28-29]，因此離體采收后，POD仍然保持較高活力，但隨著木質素單體消耗的增加，同時多酚合成不足以抵消木質素單體消耗，導致代謝底物含量下降，POD活力降低；隨著微生物侵染加劇，抗性誘導PAL活力增加，多酚含量適度增加[7,30]，POD活力升高，但由于多酚含量增加幅度較小，不足以帶來采收初期大量木質素單體積累的效果，因而POD活力升高幅度也較小，其活力仍遠低于采收初期。

從圖6可以發現，對照組和COS涂膜處理組的POD活力都遵循了先下降后略有上升的變化趨勢。相對地，ClO2殺菌處理組的POD活力在貯藏期間一直呈下降趨勢，而ClO2-COS處理組的POD活力則表現出了先下降再上升后略有下降的趨勢，但ClO2殺菌處理組和ClO2-COS處理組貯藏末期的POD活力差異都未達顯著水平（P＞0.05）。之前的研究發現，鮮食糯玉米采后木質素積累與POD活力存在顯著相關性[5]，在對竹筍、甜瓜等的研究中也發現了相同的結果[9,25-26,31]。COS涂膜處理組和ClO2-COS處理組的POD活力在貯藏期間基本低于ClO2殺菌處理組和對照組，這與其木質素積累速率（圖3）的趨勢相一致，這表明貯藏期間保持較低的POD活力有利于延緩木質素積累。ClO2-COS處理有效抑制了微生物侵染，且抑制了POD活力，使得木質素的積累下降。

3 結 論

鮮食糯玉米采后貯藏期間微生物侵染會造成木質素積累，使產品柔嫩度下降、質地劣化。ClO2殺菌處理可以降低微生物侵染基礎，COS涂膜處理則可以產生誘導抗性。二者單獨應用均具有一定的抑菌效果，而采用先殺菌后涂膜的ClO2-COS復合處理表現出了良好的抑菌能力，能夠有效地抑制微生物侵染，降低抗性誘導效應。ClO2-COS處理能夠降低木質素積累速率，降低多酚含量并使其基本保持較低水平，延緩木質素快速積累。ClO2-COS處理可以抑制PAL活力過快上升，降低苯丙烷代謝水平，還能降低POD活力，使其在貯藏期間一直保持較低水平，使木質素積累趨勢平緩，從而保持糯玉米的柔嫩質地。