拮抗酵母菌揮發物單體對草莓灰霉病的防治效果

余 偉，宋 玥，佘仲露，奚裕婷，郭虹娜，蔣春號，肖紅梅,*

（1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.南京農業大學植物保護學院，江蘇 南京 210095）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，因其色澤鮮艷、口感酸甜深受消費者的喜愛，又因為其含有豐富的營養物質，被稱為“水果皇后”。由于草莓是漿果類水果，皮薄多汁，在采收、包裝、運輸等過程中，極易受到碰傷、擠壓、振動等物理性因素的損害，從而造成病原真菌侵染，引起果實腐爛[1-2]。由灰霉菌引起的灰霉病是草莓采后主要真菌性病害，對草莓品質影響極大，縮短了其銷售壽命[3]。

隨著人們對食品安全和環境保護問題關注程度的增加，尋求安全、高效、環境友好的生物防治方法已成為趨勢。目前用于防治果蔬采后病害的生物防治手段主要有植物、微生物及其代謝物。微生物可以產生大量種類豐富、功能多樣的揮發性物質，能產生揮發性物質的微生物種類主要有細菌、酵母、放線菌、霉菌等[4-6]。目前，已經有600 種微生物所釋放的1 300 種揮發性物質被登記[7]。李其利[8]的研究表明鏈霉菌JK-1產生的揮發物能夠抑制灰霉菌及柑橘青霉菌菌絲生長、孢子萌發及孢子形成等，并通過氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀鑒定出41 種揮發性化合物，包括烴類、酯類、醇類、醚類及有機酸等。陳利軍等[9]發現產香真菌GS-1產生的揮發物對番茄灰霉病菌、水稻胡麻斑病菌、小麥赤霉病菌、白菜黑斑病菌以及萵苣菌核病菌均有抑制作用，其中對灰霉菌抑制效果最好。Xie Shanshan等[10]通過透射電子顯微鏡發現芽孢桿菌菌株D13產生的揮發物氣體能改變水稻白葉枯病菌菌絲形態及胞內內容物，并從轉錄水平發現病原菌毒力表達基因下降。黃蓉[11]從發病草莓上分離出7 株酵母，其中間型假絲酵母C410、近玫色鎖擲孢酵母YCXT3、漢遜德巴利酵母W4682、出芽短梗霉YW1均能產生揮發物，且對灰葡萄菌的菌絲生長及孢子萌發均有抑制作用，并通過GC-MS分析了C410和YCXT3中的部分抗菌成分如2-壬酮、異己酸乙酯、1,3,5,7-環辛四烯、反式2-己烯基己酸等。周海蓮[12]、Qin Xiaojie[13]等的研究表明葡萄汁有孢漢遜酵母的揮發物抑制灰霉菌絲生長，影響病原菌孢子萌發及生長，并通過GC-MS分析出葡萄汁有孢漢遜酵母揮發物的主要抑菌成分有丙酸乙酯、3-羥基己酸乙酯、己酸、肉桂醛等。

目前雖然有很多關于微生物產生具有抑菌作用揮發性物質的報道，但由于揮發性物質成分復雜，防治果蔬采后病害機制仍然未明了；因此研究揮發物單體對病原菌及果蔬的防治作用，能對進一步闡明其作用機理和未來的商業化應用提供基礎[14]。本實驗通過分析葡萄汁有孢漢遜酵母揮發性代謝物中的21 種單體（相對色譜峰面積大于0.1%）對灰葡萄孢的菌絲生長及孢子萌發等的影響，并從中篩選出4 種單體研究對草莓灰霉病的防治效果，從而進一步揭示葡萄汁有孢漢遜酵母揮發物防治草莓灰霉病的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓果實（Fragaria×ananassa Duch），品種為‘紅顏’，采摘于南京市鎖石生態園。選用八成熟、無病蟲害、無機械損傷、無腐爛、大小一致的果實進行實驗。

灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）從草莓果實上分離純化得到，保藏在4 ℃ PDA斜面培養基上。使用前從斜面培養基將病原菌接種到PDA平板上，25 ℃恒溫培養7 d活化。

實驗所用試劑均為分析純，購自阿拉?。ㄉ虾＃┰噭┯邢薰尽?/p>

1.2 儀器與設備

102光學顯微鏡 日本尼康公司；HZQ-F160全溫振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠；TGL20M臺式高速冷凍離心機 湘儀儀器有限公司；恒溫恒濕培養箱 寧波海曙賽富實驗儀器廠；XB-K-25血球計數板 國營上海醫用光學儀器廠；HVE-50自動蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama有限公司；HP-2136便攜式色差儀 上海譜熙光電科技有限公司；WYT-4型手持糖量儀 紹興市億納儀器制造有限公司；TMS-PRO食品物性分析儀 美國FTC公司；BSA124S-CW電子天平 上海精科儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 供試菌株菌懸液制備

B. cinerea菌懸液制備：將少量無菌水倒入培養好的灰葡萄孢霉PDA平板上，用接種環輕輕刮下孢子，充分振蕩，用4 層無菌紗布過濾。取其濾液，用無菌水配制成1×106spore/mL的孢子懸浮液。

1.3.2 揮發物單體對B. cinerea菌絲生長抑制效果的測定

根據周海蓮[12]、Qin Xiaojie[13]等的實驗結果，篩選出葡萄汁有孢漢遜酵母產生的21 種揮發物單體物質。將其中的固體單體配制成溶液，取4 g用無水乙醇定容至50 mL，再取100 μL溶液，假定培養皿體積為0.08 L，此時整個培養皿中揮發物氣體質量濃度為100 mg/L。將揮發物氣體依次梯度稀釋成50.0、10.0、5.0、2.5 mg/L。采用平板倒扣法并略作改進：用無菌打孔器取培養了5 d的病原菌菌餅（直徑0.8 cm），接于一PDA平板正中央，在培養皿蓋上放置已滅菌的直徑約為1 cm的濾紙片，用移液槍移取揮發物單體（液體單體：直接取100.0、50.0、10.0、5.0、2.5 μL，對應劑量分別為31.25、62.5、125、625、1 250 μL/L）于濾紙片上，液體單體組以濾紙片不添加揮發物單體為對照、固體單體組以濾紙片添加100 μL無水乙醇為空白對照，迅速扣好皿蓋，用封口膜封住培養皿邊緣。置于（25±1）℃、相對濕度90%～95%的恒溫恒濕條件下倒扣培養3 d后，采用十字交叉法測量處理組和空白對照組菌落直徑。每個處理3 個平板。整個實驗重復2 次。按照公式（1）計算揮發物單體對B. cinerea菌絲生長的抑制率。

式中：d1為對照組菌絲直徑/cm；d2為處理組菌絲直徑/cm；d3為菌餅直徑（0.8 cm）。

1.3.3 揮發物單體對B. cinerea孢子萌發影響的測定

取0.1 mL孢子懸浮液涂布平板，在培養皿皿蓋上放置滅菌過的直徑約為1 cm的濾紙片，用移液槍移取揮發物單體（液體單體分別為100.0、50.0、10.0、5.0、2.5 μL；固體單體溶液為100 μL）于濾紙片上，以濾紙片不添加揮發物單體為空白對照（CK），迅速扣好皿蓋，用封口膜封住培養皿邊緣。置于（25±1）℃、相對濕度90%～95%的恒溫恒濕條件下培養，12 h后觀察孢子的萌發率。每處理3 個平行，實驗重復2 次。

1.3.4 4 種單體對草莓果實灰霉病防治效果的測定

按照1.3.2節和1.3.3節的結果以及剔除文獻中已發表過的單體，篩選出4 種單體進行下一步實驗。

取15 個小干燥器（直徑150 mm），每個干燥器上層放10 顆八成熟草莓，用6 mm×6 mm×6 mm的一次性打孔器在草莓腰部打孔，注入20 μL灰葡萄孢子懸浮液，晾干后待用。對照組（CK組）：濾紙片上不添加任何物質；處理組：濾紙片上分別添加3-羥基己酸乙酯、癸酸乙酯、肉桂醛、辛酸乙酯250 μL。將濾紙片置于干燥器底部，干燥器密封，于（25±1）℃、相對濕度90%～95%的恒溫恒濕條件下放置5 d后進行外觀觀察并測定指標。發病率按照式（2）進行計算。

色差采用HP-2136便攜式色差儀測定；可溶性固形物（total soluble solids，TSS）質量分數采用WYT-4型手持糖量儀測定；可滴定酸質量分數根據GB/T 12456《食品中總酸的測定》[15]測定；質構特性采用TMS-PRO食品物性分析儀測定，設置參數為：下壓速率60 mm/s，形變量40%，高度40 mm，兩次壓縮中間的停頓時間為5 s，觸發力為4.0 N。

1.4 數據統計與分析

所得結果為各處理組平均值，數據分析采用SPSS 20軟件的Duncan方差分析，圖表繪制采用Orign 2018軟件。

2 結果與分析

2.1 揮發物單體對B. cinerea菌絲生長和孢子萌發的抑制結果

21 種揮發物單體中，酯類、醇類、酸類、醛類、酮類和酚類分別為10、5、3、1、1 種和1 種。由表1可以看出，除月桂酸，其余20 種單體均對B.cinerea菌絲生長有抑制作用。其中酯類中，辛酸乙酯的抑制效果最好，完全抑制劑量為125 μL/L；醇類中，苯甲醇抑制效果最好，完全抑制劑量為125 μL/L；酸類中，正己酸的效果最好，完全抑制劑量為625 μL/L。在20 種單體中，2-壬酮和桂皮醛的抑制效果最好，完全抑制菌絲生長劑量為62.5 μL/L，其次是辛酸乙酯、苯甲醇，劑量為125 μL/L，正己醇、丙酸乙酯、正己酸、2-甲基丁酸乙酯、2-苯乙醇完全抑制菌絲生長的劑量為625 μL/L，3-苯丙醇、3-羥基己酸乙酯、3-羥基丁酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯完全抑制菌絲生長的劑量均大于1 250 μL/L，4-乙基苯酚及正癸酸完全抑制菌絲生長的劑量均大于100 mg/L。由表2可知，21 種單體均對B. cinerea孢子萌發有抑制作用，抑制效果與劑量呈正相關。桂皮醛抑制效果最好，在625 μL/L時完全抑制孢子萌發；其次是2-壬酮和正己醇、乙酸異丁酯，在1 250 μL/L時完全抑制孢子萌發，其他揮發物單體均不能完全抑制孢子萌發。

表1 21 種單體對灰葡萄孢霉菌絲生長的影響Table1 Effects of 21 volatile monomers on mycelium growth of B. cinerea

表2 21 種單體對灰葡萄孢霉孢子萌發的影響Table2 Effects of 21 volatile monomers on conidial germination of B. cinerea

2.2 4 種揮發物單體對草莓果實灰霉病的防治效果

2.2.1 外觀與發病率

圖1 4 種揮發物單體對草莓灰霉病外觀的影響Fig.1 Effects of 4 volatile monomers on strawberry appearance

草莓的外觀和發病情況是草莓貯藏效果最直觀的反映。由圖1可以看出，與剛采摘的草莓相比，CK組草莓有很明顯的發病，草莓上長滿了菌絲，處理組均無明顯發病跡象。圖2顯示CK組發病率超過70%，3-羥基己酸乙酯、癸酸乙酯、桂皮醛和辛酸乙酯均可以不同程度地防治草莓灰霉病，發病率在20%以下，其中3-羥基己酸乙酯和桂皮醛防治效果最好，發病率為0%。

圖2 4 種揮發物單體對草莓灰霉病發病率的影響Fig.2 Effects of 4 volatile monomers on gray mold incidence in strawberry

2.2.2 色差

色差可以判定果實的成熟度和外觀。色差Lab中L值表亮度，值越大表明果實亮度越好，a值為正值時表示紅度，為負值時表示綠度。由圖3A、B可以看出，貯藏期間草莓的L值降低，亮度下降，a值上升，紅度上升，說明貯藏后草莓果實光澤度降低而紅度增加。除了桂皮醛處理組的草莓a值顯著低于CK組外（P＜0.05），其他處理組的L值和a值與CK組差異均不顯著（P＞0.05）。說明桂皮醛能夠維持草莓在貯藏期間的色澤。

圖3 4 種揮發物單體處理對草莓L值（A）、a值（B）的影響Fig.3 Effects of 4 volatile monomers on L value (A) and a value (B)of strawberry

2.2.3 TSS質量分數

圖4 4 種揮發物單體處理對草莓TSS質量分數的影響Fig.4 Effects of 4 volatile monomers on total soluble solid content of strawberry

果蔬中TSS質量分數能直接反映成熟度和品質，其高低是判斷耐貯藏性的重要指標之一。由圖4可以看出，草莓在貯藏期間其TSS質量分數下降，其中CK組約下降到8.9%左右，癸酸乙酯和辛酸乙酯處理后的草莓TSS質量分數分別為8.92%和9.03%，與CK組差異不明顯，桂皮醛處理后的草莓TSS質量分數變化最小，為9.7%。揮發物單體處理在一定程度上可以延緩草莓在貯藏期間TSS質量分數的下降，其中桂皮醛處理效果最好。

2.2.4 可滴定酸質量分數

圖5 4 種揮發物單體處理對草莓可滴定酸質量分數的影響Fig.5 Effects of 4 volatile monomers on titratable acid content of strawberry

果實的酸含量是影響草莓風味和貯藏性的重要因素，有機酸是其主要影響因子。草莓中的有機酸主要是檸檬酸和蘋果酸，其中檸檬酸約占80%～90%。由圖5可以看出，草莓在貯藏期間可滴定酸質量分數下降，揮發物單體處理后草莓的可滴定酸質量分數均高于CK組，其中桂皮醛處理后的草莓可滴定酸質量分數與鮮樣沒有顯著差異（P＞0.05），說明桂皮醛處理能夠延緩草莓在貯藏期間可滴定酸質量分數的下降。

2.2.5 質構特性

質構特性是評價果蔬品質的重要指標之一，果實的許多感官指標如硬度、脆性、彈性、咀嚼性等都與草莓質構特性有關。硬度在一定程度上反映果實對外力的抵抗性，與其組織結構和成熟程度有關；彈性一般指果實受到外力發生形變后恢復原有形態的能力，一般取決于細胞壁的完整性；膠黏性則用來表明果實的完整性，其值越高，代表果實的品質越完好；咀嚼性可以間接反映果實硬度。

圖6 4 種揮發物單體處理對草莓硬度（A）、彈性（B）、膠黏性（C）、咀嚼性（D）的影響Fig.6 Effect of 4 volatile monomers on hardness (A), springiness (B),gumminess (C) and chewiness (D) of strawberry

從圖6A～D可以看出，在貯藏期間，草莓果實的硬度、彈性、膠黏性、咀嚼性均下降，揮發物單體處理后草莓果實的硬度、彈性、膠黏性與CK組相比無顯著差異（P＞0.05），但變化值小于CK組，咀嚼性則是揮發物單體處理組與CK組有顯著差異（P＜0.05），但4 個揮發物單體處理組間沒有顯著差異。相對來說，桂皮醛處理后的草莓果實其硬度、彈性、膠黏性、咀嚼性的變化值均小于其他組，說明桂皮醛能在一定程度上維持草莓在貯藏期間的硬度、彈性、膠黏性和咀嚼性。

3 討 論

利用微生物防治果蔬采后病害已成為研究熱點。除了利用自身的抑菌特性，微生物還可以產生大量種類豐富、功能多樣的揮發性物質，這些揮發性物質也具有抑菌特性[16]。陳利軍等[17]研究表明產香真菌ZY-2的揮發物對草莓灰霉病菌、水稻胡麻斑病菌、小麥赤霉病菌、白菜黑斑病菌和萵苣菌核病菌具有很好的抑制作用，并通過GC-MS分析出其主要的抑菌成分是2-苯乙醇。Zhang Xiaoyun等[18]研究發現萎縮芽孢桿菌CAB-1的揮發物可以延緩灰葡萄孢霉孢子萌發和抑制菌絲生長，并利用GC-MS分析出26 種典型物質，如丙酰胺、鄰茴香醛、L-氨基丙醇等，其中鄰茴香醛的抑制效果最好。陳奕鵬等[19]發現內生真菌HND5的揮發物也具有抑菌作用，并通過GC-MS分析出14 種單體化合物，其中石竹烯和4-乙烯基-1,2-二甲氧基苯對尖孢鐮刀菌、膠胞炭疽菌和多主棒孢菌具良好的抑制作用。Toffano等[20]研究發現釀酒酵母產生的揮發物能抑制柑橘葉點霉病，并且從分析出的7 種物質中發現，3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇可以抑制柑橘葉點霉菌絲生長和孢子萌發以及附著胞的形成。Gao Haiyan等[21]研究發現枯草芽孢桿菌CF-3的24 h發酵液產生的揮發物可以抑制灰葡萄孢菌和炭疽病菌等，并從這些揮發物中鑒定出77 種成分，其中2,4-二叔丁基苯酚在體外表現出較強的抑制作用。本實驗發現，在所研究的21 種揮發物單體中，2-壬酮、桂皮醛等20 種揮發物單體均對灰霉的菌絲生長和孢子萌發有很好的抑制作用，而月桂酸對孢子萌發是抑制作用而對灰葡萄孢菌絲生長表現出促進作用。富饒等[22]研究表明月桂酸可以抑制番茄葉霉菌的菌絲生長，表現出“低抑高促”的現象，最佳濃度為0.01 mmol/L，本實驗中月桂酸最小抑制的質量濃度為2.5 mg/L，即0.012 5 mmol/L，所以月桂酸可能表現出促進菌絲生長。對于孢子萌發，月桂酸則表現出抑制作用，具體原因有待進一步研究。

20 種單體對灰葡萄孢菌絲生長和孢子萌發均有抑制作用，其中效果最好的是2-壬酮和桂皮醛。Huang Rong等[23]研究發現Candida intermedia可以產生49 種揮發物物質，其中2-壬酮對灰霉的抑制效果最好，對菌絲生長和孢子萌發的半抑制濃度為10 μL/L。Abarca等[24]研究發現采用含2-壬酮的包裝材料在20 ℃下可以抑制灰霉菌絲生長，降低番茄灰霉病的發生，低溫可以加強防治效果。吳克剛等[25]通過抑菌圈法研究肉桂醛、百里香酚、香芹酚、丁香酚、茴香腦和檸檬醛對幾種常見有害微生物的抑菌敏感性，結果表明肉桂醛對真菌抑菌能力更強，對黃曲霉的抑菌效果最好。孫琦[26]的研究表明肉桂醛具有抑制黃曲霉菌生長和黃曲霉毒素B1代謝的雙重效應，當濃度達到0.8 mmol/L時可以完全抑制菌絲生長和產毒能力。3-羥基己酸乙酯、癸酸乙酯、桂皮醛以及辛酸乙酯均可以防治草莓灰霉病，其中防治效果最好的是桂皮醛。桂皮醛又名肉桂醛，主要存在于肉桂、月桂等香料中，具有很好的抑菌作用[27-28]。張娜娜等[29]的研究表明肉桂醛可以抑制灰葡萄孢菌的菌絲生長和孢子萌發，對菌絲生長的半最大效應濃度為95.6 μg/mL，質量濃度為60 μg/mL時對孢子的萌發抑制率為100%；在活體條件下，4 000 μg/mL的肉桂醛可以降低番茄果實質量損失率，維持番茄的貯藏品質，降低番茄灰霉病的發生。段小芳[30]的研究結果表明，肉桂醛對柑橘酸腐菌和指狀青霉都具有較好的抑制作用，且隨著抑菌劑質量濃度的升高抑菌效果增強，其最小抑菌濃度、最小殺菌濃度均為0.5 mg/mL；在活體條件下，果蠟+肉桂醛的復合處理可以有效降低柑橘果實腐爛率和失水率，保持果實品質，延長貨架期。Wang Yuan等[31]研究表明，肉桂醛處理可以顯著減少獼猴桃在貯藏期間微生物數量，同時可以保持獼猴桃品質，延緩衰老，增強其抗氧化能力。本實驗結果也表明，相對于其他揮發物單體，桂皮醛能顯著降低草莓果實貯藏期間的發病率，保持草莓色澤，抑制草莓TSS、可滴定酸質量分數及質構特性的下降，保持草莓貯藏品質。

本實驗結果表明葡萄汁有孢漢遜酵母揮發性代謝物中的桂皮醛、2-壬酮等20 種單體均對灰葡萄孢菌絲生長和孢子萌發有不同程度的抑制作用，在活體條件下，桂皮醛處理能更好地維持草莓果實品質，降低發病率。下一步將對桂皮醛等20 種單體的抑菌機理以及其他單體對草莓灰霉病的防治效果進行深入研究，從而為揭示葡萄汁有孢漢遜酵母防治草莓灰霉病提供更多參考。