山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)中波紫外線輻射HaCaT細(xì)胞氧化損傷和光老化的保護(hù)作用

劉素穩(wěn)，吳瞻邑，由 璐，常學(xué)東*

（河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 秦皇島 066604）

陽光中的紫外線輻射是造成皮膚損傷的主要原因[1]。由于平流層臭氧層的破壞增加了地球大氣中的紫外線輻射，過度暴露于紫外線輻射對(duì)人體健康有許多不利影響，如導(dǎo)致皮膚癌、免疫抑制、太陽紅斑和皮膚過早老化等。中波紫外線（ultraviolet B，UVB）（280～320 nm）是引起人永生化表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）輻射損傷的最重要因素，且UVB輻射可增加皮膚組織中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和自由基的生成量，引起一系列的氧化損傷。UVB也是造成皮膚光老化的主要原因之一，其可以穿透表皮到達(dá)真皮（主要由成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成）上部，激活人類皮膚中基質(zhì)金屬蛋白（matrix metalloproteinases，MMPs）調(diào)節(jié)的信號(hào)通路[2]，誘導(dǎo)皮膚光老化。皮膚光老化特征為產(chǎn)生皺紋、不規(guī)則色素沉著和缺乏彈性[3]。此外，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和白介素（interleukin，IL）-6是與UVB輻射有關(guān)的炎癥細(xì)胞因子，輻射后，這些因子大量分泌，造成角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)并加速細(xì)胞損傷[4]。

目前，保護(hù)人類皮膚免受太陽紫外線誘導(dǎo)的氧化損傷的主要方式是避免過度暴露在陽光下或使用防曬霜。植物化學(xué)物質(zhì)的補(bǔ)充也可以起到保護(hù)作用，最近的一些研究表明天然的化學(xué)組分也能起到一定的抗氧化保護(hù)作用，例如葡萄種子提取物、鹽膚木提取物、枸杞多糖、雪蓮多糖等[5-9]。山楂屬于薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pyrinae）山楂屬（Crataegus）植物，果膠含量豐富，約占果實(shí)質(zhì)量的2%～4%。果膠是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的酸性雜多糖，其主要成分為半乳糖醛酸，具有良好的乳化、增稠、穩(wěn)定和膠凝作用。研究表明，由果膠水解得到的果膠低聚半乳糖醛酸具有降血脂、降血糖、防齲齒、抑菌等多種生物活性[10-12]。

目前還鮮有關(guān)于山楂半乳糖醛酸提取物對(duì)UVB輻射HaCaT細(xì)胞氧化損傷及光老化保護(hù)作用的研究。本實(shí)驗(yàn)以山楂為原料提取山楂果膠，采用酶法降解，對(duì)酶解物半乳糖醛酸進(jìn)行分離制備，研究山楂果膠低聚半乳糖醛酸的基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase 1，MMP-1）抑制活性，并對(duì)UVB輻射造成的氧化損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究，對(duì)山楂功能食品和山楂皮膚保護(hù)產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果膠酶（食品級(jí)） 法國Lallemand公司；Dowex50W×8-200陽離子交換樹脂、DMEM培養(yǎng)基美國Gibco公司；胎牛血清 美國Hyclone公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 武漢雙螺旋生物科技有限公司；Dowex1×4-400陰離子交換樹脂、胰酶、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、ROS試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismulase，SOD）試劑盒沈陽萬類生物科技有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）試劑盒南京建成生物工程研究所；M M P-1試劑盒中國博士德生物公司；HaCaT細(xì)胞 南京華奧生物有限公司；TNF-α、IL-6細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 美國R&D公司；RNA測(cè)定試劑盒 北京百泰克生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FDU-1200冷凍干燥機(jī) 日本Eyela東京理化株式會(huì)社；DHA-A電腦恒流泵 上海嘉鵬科技有限公司；100-LCD電腦自動(dòng)部分收集器 上海琪特分析儀器有限公司；NW10LVF型超純水系統(tǒng) 香港Heal Force公司；H-2050R型超速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀有限公司；HF-90型CO2培養(yǎng)箱 上海力申有限公司；AE31倒置相差顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化儀器設(shè)備公司；ELX-800型酶標(biāo)儀 美國Biotek公司；UV2910紫外-可見分光光度計(jì)日本日立公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾有限公司；DH36001B電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特公司；SUV-100日光紫外線模擬器、UVB輻射度監(jiān)示器上海西格瑪高技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀BIONEER（上海）公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 果膠提取

將山楂清洗、去皮、去核、打漿，用0.81 mol/mL鹽酸溶液以料液比1∶20在80 ℃條件下提取90 min。提取液經(jīng)離心棄去殘?jiān)? 倍體積乙醇沉淀，經(jīng)冷凍干燥制得果膠[13]。

1.3.1.2 果膠酸制備

稱取3 g山楂果膠溶于300 mL含40 g/L NaOH的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液中，冰浴攪拌反應(yīng)5 h，于冰箱中冷藏10 h，過濾，棄上清液。沉淀加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液100 mL，用3 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至1.5±0.1。室溫下攪拌30 min，抽濾，沉淀中加入50%酸化（體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸溶液）乙醇溶液，攪拌30 min，過濾，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液洗滌3 次，冷凍干燥得果膠酸。1 g果膠酸溶于100 mL pH 4.5醋酸鈉緩沖液（0.9 g醋酸鈉與0.5 mL冰醋酸定容至50 mL，溶劑為蒸餾水）制成果膠酸樣品，備用。

1.3.1.3 果膠酸酶解

用0.1 mol/L PBS（pH 4.5）配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的果膠酸待解液，用質(zhì)量濃度為0.000、0.005、0.010、0.015、0.020 mg/mL酶解液對(duì)其進(jìn)行酶解[14]。分別于30、45、60、75、90 min時(shí)取樣2 mL，沸水浴5～10 min滅活后進(jìn)行1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）抗氧化能力測(cè)定，篩選抗氧化能力強(qiáng)的酶解物，確定果膠酸最佳酶解條件，并將酶解液冷凍干燥。

1.3.1.4 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物的分離

準(zhǔn)確稱取果膠酸500 mg溶于PBS（pH 4.5）中，質(zhì)量濃度為10 mg/mL，酶解后沸水浴5～10 min滅活，4 000 r/min離心10 min，取上清液冷藏備用。用“堿-酸-堿”方式處理Dowex1×4-400陰離子交換樹脂，用“酸-堿-酸”方式處理Dowex50W×8-200陽離子交換樹脂，使其活化。選用40 cm×1.5 cm玻璃柱，用1 mol/L甲酸溶液沖洗樹脂，使pH值至1.5左右，樹脂轉(zhuǎn)化為HCOO－型，水洗至中性備用。取山楂果膠低聚半乳糖醛酸混合物，調(diào)節(jié)pH值至6.0，用0.6 mol/L甲酸銨溶液梯度洗脫，以1 mL/min流速分部收集，每管7 mL[15]。將DPPH自由基清除能力最強(qiáng)的樣品冷凍干燥，－20 ℃保存。

1.3.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定

稱取DPPH 0.078 8 g，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液定容至1 L，得到0.2 mmol/L DPPH試劑，避光保存，備用。取樹脂分離后的各管待測(cè)樣品2 mL，加入0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液2.0 mL，混勻，靜置30 min，于517 nm波長處測(cè)定吸光度A1。以待測(cè)樣品與體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液的混合液為對(duì)照，測(cè)定吸光度A2；以DPPH溶液與體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液的混合液為空白，測(cè)定吸光度。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。

1.3.3 山楂果膠低聚半乳糖醛酸含量的測(cè)定

將分離所得低聚半乳糖醛酸混合物經(jīng)陽離子交換樹脂除鹽后進(jìn)行質(zhì)譜分析。樣品通過2 μL定量環(huán)進(jìn)樣，噴霧電壓4 kV；鞘氣3 MPa；輔助氣0.5 MPa；離子源溫度為275 ℃；電壓150 V[15,17]。山楂果膠酸性半乳糖醛酸含量的測(cè)定采用間羥基聯(lián)苯法[18]。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至90%融合后，按分組進(jìn)行UVB照射及山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物處理。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)分組及UVB輻射

按照參考文獻(xiàn)[19]的方法，并略有改動(dòng)，采用SUV-100日光紫外線模擬器及UVB輻射度監(jiān)示器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組：HaCaT細(xì)胞不照射UVB，不給予山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物處理。UVB組：HaCaT細(xì)胞進(jìn)行30 mJ/cm2UVB輻射處理40 s，距離15 cm，后更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。低、高劑量山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物處理+UVB照射實(shí)驗(yàn)組：每2 mL培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度為5 μg/mL（低劑量）或10 μg/mL（高劑量）山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物處理1 h后，進(jìn)行30 mJ/cm2UVB輻射處理，之后更換含5 μg/mL或10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.6 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

1.3.6.1 山楂半乳糖醛酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響

培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞至細(xì)胞密度為90%左右，用PBS清洗1 次，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化細(xì)胞，并加入完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。88×g離心3 min。將不同組別的細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔4×103個(gè)，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行加藥處理。樣品組每200 μL培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度0、5、10、20、40、80、150、200 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物，將96 孔板置于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)48 h后采用MTT法檢測(cè)。96 孔板內(nèi)每孔加入100 μL DMEM完全培養(yǎng)基與10 μL 5 mg/mL MTT混合液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。4 h后小心吸去上清液，加入150 μL DMSO，避光靜置10 min后在酶標(biāo)儀上測(cè)定其在570 nm波長處OD值，OD值越大表明存活率越高。

1.3.6.2 UVB輻射后山楂半乳糖醛酸提取物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

將分組后的細(xì)胞按1.3.6.1節(jié)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別用UVB和山楂半乳糖醛酸提取物處理細(xì)胞24 h后，用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率（式（2））。

式中：OD樣品組、OD對(duì)照組分別為樣品組、對(duì)照組在570 nm波長處OD值。

1.3.7 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物（MDA）含量和Hyp質(zhì)量濃度的測(cè)定

將分組的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用新鮮裂解緩沖液重懸至密度為107個(gè)/mL。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)定MDA含量和Hyp質(zhì)量濃度。

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定

細(xì)胞內(nèi)的ROS水平測(cè)定按照Silván等[19]的方法，加入10 μmol/L 2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽于各組培養(yǎng)基，分組方法參見1.3.5節(jié)。37 ℃孵育細(xì)胞30 min。收集細(xì)胞，1 000×g離心10 min，去上清液，用200 μL PBS重懸細(xì)胞。使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，激發(fā)光波長為485 nm，發(fā)射光波長為530 nm。測(cè)定結(jié)果以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示。

1.3.9 細(xì)胞內(nèi)酶活力的測(cè)定

細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT和LDH活力采用試劑盒檢測(cè)，細(xì)胞培養(yǎng)及樣品處理方法見1.3.5節(jié)，按照試劑盒操作說明對(duì)4 種酶活力進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.10 ELISA法檢測(cè)MMP-1含量、TNF-α及IL-6質(zhì)量濃度

蛋白質(zhì)提取和定量測(cè)定按照試劑盒說明書方法操作。細(xì)胞培養(yǎng)及樣品處理方法見1.3.5節(jié)，依照ELISA試劑盒說明書測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組MMP-1含量、TNF-α及IL-6質(zhì)量濃度。

1.3.11 qPCR檢測(cè)

將HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10% PBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。將分組后的細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為4×103個(gè)，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后測(cè)定相關(guān)基因（MMP-1、T N F-α和I L-6）的表達(dá)量。采用試劑盒提取總RNA。將20 μL反轉(zhuǎn)錄RNA獲得的相應(yīng)cDNA置于－20 ℃，采用PCR儀測(cè)定。mRNA核苷酸序列內(nèi)參采用β-actin，引物由上海生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列為：MMP-1上游引物：5’-CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA-3’，下游引物：5’-A A G G T T A G C T T A C T G T C A C A C G C T T-3’； T N F-α上 游 引 物 ：5’-CCAGACCCTCACACTCAGAT-3’，下游引物：5’-AACACCCATTCCCTTCACAG-3’；IL-6上游引物：5’-GCTATGAAGTTCCTCTCTGC-3’，下游引物：5’-CTAGGTTTGCCGAGTAGATC-3’。結(jié)果以2－ΔΔCt方法計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂果膠酶解液及低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的影響

圖1 酶解液質(zhì)量濃度（A）、酶解時(shí)間（B）及山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物（C）對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration (A), hydrolysis time (B) and hawthorn pectin oligogalacturonides (C) on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates

由圖1可知，在相同酶解液質(zhì)量濃度下，隨著酶解時(shí)間的延長，酶解物的DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在60 min、酶解液質(zhì)量濃度0.05 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率最高。這可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間較短時(shí)果膠多糖降解不充分，酶解液中多為大分子聚半乳糖醛酸，其抗氧化能力弱；而隨著酶解時(shí)間延長，果膠多糖過度降解為單糖，使得酶解液抗氧化能力逐漸降低。相同酶解時(shí)間下，隨著酶解液質(zhì)量濃度的增加，酶解液DPPH自由基清除率逐漸降低，這是因?yàn)槊附庖嘿|(zhì)量濃度越大，相同酶解時(shí)間內(nèi)果膠多糖酶解越徹底，半乳糖醛酸聚合度降低，故其抗氧化能力逐漸降低。

隔管測(cè)定陰離子交換樹脂分離液，自第9號(hào)提取物濃度管開始收集，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物的DPPH抗氧化能力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在第21號(hào)提取物濃度管獲得DPPH抗氧化能力最強(qiáng)樣品，其DPPH自由基清除率達(dá)80.6%。

2.2 山楂果膠低聚半乳糖醛酸含量分析

利用質(zhì)譜對(duì)分離后的山楂低聚半乳糖醛酸進(jìn)行聚合度分析，得到5 種不同聚合度的醛酸。在正離子模式下，由于洗脫過程中NH4+離子的引入，圖譜中同時(shí)存在[M+Na]+、[M+NH4]+離子峰，其中m/z為745、921、1 273、1 525分別是半乳糖醛酸聚合度為4、5、7、9的[M+Na]+峰。m/z為1 109是聚合度為3的低聚半乳糖醛酸的[2M+NH4]+峰[20]。通過間羥基聯(lián)苯法對(duì)分離純化后山楂果膠酸酶解液中酸性半乳糖醛酸含量的測(cè)定結(jié)果為87%。

2.3 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

圖2 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞（A）及經(jīng)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞（B）的增殖作用Fig.2 Cytotoxic effects of hawthorn pectin oligogalacturonide on HaCaT cells (A) and protective effect against UVB irradiation (B)

由圖2A可知，5、10 μg/mL的山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)細(xì)胞沒有顯著影響（P＞0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度在20～200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率隨質(zhì)量濃度增大呈減小趨勢(shì)，表明山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)細(xì)胞的損傷有一定限度。經(jīng)UVB照射后，5、10 μg/mL的山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)細(xì)胞有一定保護(hù)作用（圖2B）。5、10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物使細(xì)胞相對(duì)存活率分別顯著提升37.7%和72.4%（P＜0.05），且兩劑量組間有顯著差異（P＜0.05）。

2.4 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物（MDA）含量和ROS水平分析

圖3 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞UVB輻射后MDA含量（A）和ROS水平（B）的影響Fig.3 Effects of hawthorn pectin oligogalacturonide on MDA (A) and ROS levels (B) of HaCaT cells after UVB irradiation

如圖3所示，經(jīng)UVB輻射后，細(xì)胞產(chǎn)生大量MDA和ROS，與對(duì)照組相比有極顯著差異（P＜0.01）。山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物可有效降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量和ROS水平，保護(hù)細(xì)胞，減輕氧化損傷。與UVB組比較，5、10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物使MDA含量分別降低30.1%和39.8%（P＜0.01），使ROS水平分別降低12.0%和23.9%（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)細(xì)胞酶活力的影響

圖4 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞UVB輻射后抗氧化酶（A～C）和LDH活力（D）的影響Fig.4 Effects of hawthorn pectin oligogalacturonide on antioxidase (A-C)and LDH (D) levels of HaCaT cells after UVB irradiation

山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物有效提升經(jīng)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力（圖4A～C）。UVB輻射使細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力極顯著降低（P＜0.01）。5 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)細(xì)胞GSH-Px和CAT活力無顯著增加作用（P＞0.05），但可極顯著提升SOD活力（P＜0.01）。而10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)3 種抗氧化酶活力有顯著或極顯著提升作用（P＜0.05，P＜0.01），使3 種抗氧化酶活力分別增加54.5%、44.0%和119.3%。5、10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物分別使LDH活力降低14.2%和29.9%（P＜0.05，P＜0.01）。

2.6 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)MMP-1含量和Hyp、TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度的影響

山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物有效抑制經(jīng)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)MMP-1含量增加和TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度升高（圖5A～C）。經(jīng)UVB輻射后，MMP-1含量極顯著增加（P＜0.01），激活了MMPs信號(hào)通路，使細(xì)胞光老化加速。與UVB組相比，5、10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物使細(xì)胞內(nèi)MMP-1含量降低了31.8%和40.7%（P＜0.05，P＜0.01），顯著或極顯著降低由UVB誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度升高（P＜0.05，P＜0.01），并使Hyp質(zhì)量濃度分別顯著增加了38.3%和67.2%（圖5D）。

圖5 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞UVB輻射后TNF-α（A）、IL-6（B）、MMP-1（C）、Hyp（D）水平的影響Fig.5 Effects of hawthorn pectin oligogalacturonide on TNF-α (A),IL-6 (B), MMP-1 (C) and Hyp (D) levels in HaCaT cells after UVB irradiation

2.7 qPCR分析結(jié)果

圖6 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞UVB輻射后MMP-1（A）、TNF-α及IL-6（B）mRNA水平的影響Fig.6 Effects of hawthorn pectin oligogalacturonide on mRNA expression levels of MMP-1 (A), TNF-α and IL-6 (B) in HaCaT cells after UVB irradiation

山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物可有效抑制經(jīng)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)MMP-1、TNF-α及IL-6 mRNA水平升高（圖6）。經(jīng)UVB輻射后，MMP-1 mRNA水平極顯著升高（P＜0.01）。5、10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物顯著或極顯著降低細(xì)胞內(nèi)MMP-1、TNF-α及IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05，P＜0.01）。mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果與含量或質(zhì)量濃度檢測(cè)結(jié)果一致。

3 討 論

果膠低聚糖的抗氧化能力與果膠的來源、品種、濃度、制備方式以及聚合度密切相關(guān)。柑橘果膠聚合度與DPPH自由基清除能力關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，酸性寡糖聚合度在一定范圍內(nèi)與DPPH自由基清除率呈現(xiàn)正相關(guān)性；但高聚合度的糖分子結(jié)合緊密，分子間有較強(qiáng)的相互作用力，削弱了酸性寡糖分子中羧基、羥基等基團(tuán)的活性，因此其活性的強(qiáng)弱與果膠低聚糖的分子大小即聚合度有關(guān)[21-22]。本實(shí)驗(yàn)中，隨著分離的進(jìn)行，收集到的低聚半乳糖醛酸樣品存在著聚合度和質(zhì)量濃度的差異，因此選用DPPH自由基清除率較優(yōu)的分離液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

陽光中的紫外線在生命周期中累積，造成細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由紫外線引起的氧化應(yīng)激在皮膚細(xì)胞中引起細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，最終使細(xì)胞凋亡。山楂果膠水解后的低聚半乳糖醛酸具有較高的抗氧化活性，能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[11-12]。但對(duì)UVB誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞損傷的保護(hù)作用還有待研究。因此，對(duì)山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷和光老化保護(hù)作用進(jìn)行了研究。經(jīng)UVB輻射后，HaCaT細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量ROS，使皮膚抗氧化酶活力降低[23]，產(chǎn)生大量的自由基并攻擊細(xì)胞，導(dǎo)致氧化產(chǎn)物MDA含量增加，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。另外，UVB輻射會(huì)損傷細(xì)胞膜的脂層結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜通透性變大、細(xì)胞內(nèi)容物外流，并使LDH外泄[24]。因此，LDH漏出率可作為細(xì)胞膜損傷的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物能夠有效降低經(jīng)UVB輻射后的HaCaT細(xì)胞內(nèi)的MDA含量和ROS水平，降低LDH活力，阻止細(xì)胞膜通透性變大，從而保護(hù)細(xì)胞膜，并顯著提升受損細(xì)胞的存活率。茶葉中表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠降低細(xì)胞內(nèi)的MDA含量并降低LDH活力[24]，與本研究結(jié)果一致。

皮膚衰老是一個(gè)復(fù)雜的生物機(jī)制，主要原因是由于產(chǎn)生過多的自由基和ROS。紫外線引起的皮膚老化稱為光老化。UVB輻射能夠產(chǎn)生更多的ROS，造成氧化損傷，加速皮膚的衰老。前人研究結(jié)果顯示，多酚清除自由基的途徑是依賴抑制紫外線誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[25]。一些化合物能夠捕獲自由基，并具有抗氧化的作用，可以減輕光老化。葡萄多酚具有清除自由基的能力，從而使細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低[25]。這與本研究結(jié)果一致，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物顯著減少HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，從而保護(hù)細(xì)胞，減少氧化損傷。在皮膚光老化過程中，MDA含量、ROS水平、Hpy質(zhì)量濃度和SOD、GSH-Px、CAT活力變化都對(duì)皮膚老化產(chǎn)生重要影響。

皮膚老化引起真皮纖維的變化主要包括膠原纖維厚度、彈性、褶皺的變化。影響ROS水平的主要抗氧化酶包括GSH-Px、SOD和CAT，這些酶能夠通過多種內(nèi)源性細(xì)胞防御系統(tǒng)消除ROS，并對(duì)細(xì)胞氧化損傷有一定的保護(hù)作用。UVB輻射加速細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物的生成，使GSH-Px、SOD、CAT活力和Hyp質(zhì)量濃度降低[26]。Hyp主要存在于膠原蛋白中，與膠原蛋白的合成有直接關(guān)系，其含量的多少成為評(píng)價(jià)皮膚光老化程度的重要指標(biāo)[27]。在本研究中，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物能夠顯著提升GSH-Px、SOD、CAT活力和Hyp質(zhì)量濃度，因此能夠有效減緩皮膚光老化，促進(jìn)膠原蛋白的合成。有研究表明，蔓越莓果汁可使UVB照射的細(xì)胞中LDH活力降低，并使Hyp含量提高[28]，與本研究結(jié)果一致。

光老化的皮膚中可見一系列細(xì)胞因子如IL、MMPs、活化蛋白以及DNA損傷的增加。MMPs可降解絕大部分細(xì)胞外基質(zhì)，是皮膚光老化的直接誘因。MMP-1是MMPs的特異性內(nèi)源性抑制物，能夠抑制MMPs的活化與表達(dá)，從而阻止光老化的發(fā)生。UVB依賴誘導(dǎo)MMP-1和MMP-3調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化和羥自由基水平[29]。紫外線照射能夠上調(diào)MMPs路徑，這些路徑與皮膚損傷中的膠原蛋白降解密切相關(guān)[30]。本研究表明，細(xì)胞暴露在30 mJ/cm2UVB輻射下40 s，MMP-1 mRNA水平極顯著提升，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物能夠極顯著降低MMP-1 mRNA水平，有效抑制MMP-1分泌。據(jù)報(bào)道，海洋膠原蛋白水解物通過抑制MMP-1的表達(dá)可以抑制膠原蛋白的降解[31]，在鱈魚皮明膠蛋白酶解物中也有同樣的發(fā)現(xiàn)[32]，與本研究結(jié)果一致。

另外，TNF-α和IL-6是與UVB輻射有關(guān)的炎癥細(xì)胞因子。據(jù)報(bào)道，紫外線照射可引起HaCaT細(xì)胞的TNF-α和IL-6大量分泌[4]。TNF-α可促進(jìn)IL-1β、IL-6和IL-8等其他炎癥因子的分泌。IL-6在角質(zhì)形成細(xì)胞-成纖維細(xì)胞相互作用環(huán)路中也起著重要的作用，這些炎性因子過量分泌，進(jìn)一步加劇皮膚細(xì)胞的損傷[33]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，經(jīng)過山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物處理后，HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度明顯下降，提示山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物可以通過抑制TNF-α和IL-6的分泌，改善細(xì)胞環(huán)境，減輕UVB輻射所造成的細(xì)胞損傷。

綜上，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對(duì)UVB輻射HaCaT細(xì)胞的氧化損傷及光老化具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化酶活力、降低ROS水平、抑制MMP-1分泌以及促進(jìn)膠原蛋白合成有關(guān)。本研究為山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物作為保健食品對(duì)抑制UVB輻射造成的光氧化損傷及光老化的保護(hù)作用提供了一定的理論依據(jù)，但其抑制光氧化損傷和光老化保護(hù)作用的分子機(jī)制以及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)一步研究。