銀杏花粉黃酮苷的惡味乳桿菌B2生物轉化產物及其抗氧化活性評價

裘紀瑩，魏朝治,2，陳相艷，楊金玉，張 翔，陳蕾蕾，王易芬,*，李大鵬*

（1.山東省農業科學院農產品研究所，山東省農產品精深加工技術重點實驗室，農業部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南 250100；2.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018）

銀杏花粉是銀杏雄株的花粉，其主要活性成分為黃酮類化合物[1-2]。銀杏花粉總黃酮含量約為21.40 mg/g[3]，遠高于油菜蜂花粉（14.306 mg/g）、玉米蜂花粉（5.445 mg/g）、蘋果蜂花粉（8.462 mg/g）等蜂花粉產品[4]。銀杏花粉黃酮主要以黃酮-O-糖苷的形式存在，其中黃酮苷元主要為山柰酚以及少量的槲皮素和異鼠李素，山柰酚約占3 種苷元總量的96.71%，其連接的糖主要為D-葡萄糖、L-鼠李糖或者兩者的結合，并且多與黃酮苷元的3、7、4’位羥基相連[5]。

癌癥、糖尿病、心腦血管疾病、老年癡呆癥等疾病是目前人類的多發病，這些疾病的發生都與由自由基引起的氧化損傷有關[6]。黃酮類化合物是一種良好的天然來源抗氧化劑，廣泛存在于植物界，尤其是中藥材中，能夠直接清除體內自由基、螯合金屬離子、促進抗氧化因子再生和提高抗氧化酶的水平等，因而備受關注[7-9]。同時，其抗氧化活性與結構有著很大的關系，如羥基數目與位置、雙鍵位置、糖苷鍵結構等[10]。

生物轉化技術是近年來發展起來的，可以通過改變黃酮類化合物的化學結構從而改變其物理化學性質、提高其生物利用率和功能活性的方法。研究證實，通過生物轉化，黃酮糖苷可被轉化為苷元，更易被人體吸收利用，而且黃酮苷元清除人體自由基的活性明顯優于黃酮糖苷[11-13]。本研究在前期篩選到一株生物轉化銀杏花粉黃酮苷菌株——惡味乳桿菌B2（Lacbacillus perolens B2）的基礎上，研究其生物轉化對銀杏花粉黃酮組分及其體外2,2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（2-2’-azino-bis-(3-ethyl-benzthia-zoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和減緩由于H2O2損傷引起的小鼠巨噬細胞RAW264.7凋亡的影響，以期為深入利用銀杏花粉資源、開發高活性抗氧化產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏花粉采自山東郯城，干燥過100 目篩；L. perolens B2由山東省農業科學院農產品研究所食品微生物實驗室從手工泡菜中分離，經過菌株鑒定并凍存保種；RAW264.7細胞購于美國模式菌種收集中心細胞庫，凍存保種。

ABTS、DPPH、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）浙江天杭生物科技有限公司；DMEM細胞培養基 美國Gibco公司；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

NE-1001型旋轉蒸發儀 日本東京理化器械株式會社；6132型核酸蛋白測定儀 德國Eppendorf公司；MK3型酶標儀 上海熱電儀器有限公司；UV-160型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；HF90型CO2培養箱 上海力申科學儀器有限公司；TE2000倒置相差顯微鏡 日本尼康公司；1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 銀杏花粉黃酮苷的生物轉化

L. perolens B2接種于MRS肉湯培養基，37 ℃培養24 h，混勻并取一環于MRS平皿劃線，37 ℃培養24 h，挑單菌落復劃線于MRS平皿，傳代2 次即為活化菌株。活化后的菌株取一環接種于5 mL MRS肉湯培養基，37 ℃培養24 h，調整菌液OD600nm為0.4，即為種子液。

1 kg銀杏花粉加4 L去離子水，混勻后于121 ℃滅菌20 min。按2%的接種量接種種子液，混勻后于37 ℃培養箱靜置培養72 h，所得發酵培養物即為轉化產物。

1.3.2 銀杏花粉及其轉化產物的提取物及萃取物制備

銀杏花粉原料及其生物轉化產物分別以加熱回流提取，具體條件為：乙醇體積分數70%，料液比1∶10，提取溫度75 ℃，提取時間2 h，提取3 次。最后合并濾液，減壓濃縮，并冷凍干燥，得到銀杏花粉提取物（c-1）和轉化產物提取物（c-2）。提取物加水重懸，石油醚與水1∶1（V/V）萃取3 次，上層石油醚相減壓濃縮，凍干，得到銀杏花粉石油醚萃取物（p-1）和轉化產物石油醚萃取物（p-2）。下層水相依次加乙酸乙酯、正丁醇1∶1（V/V）萃取3 次，減壓濃縮，凍干，分別得到銀杏花粉乙酸乙酯萃取物（e-1）和正丁醇萃取物（n-1），以及轉化產物乙酸乙酯萃取物（e-2）和正丁醇萃取物（n-2）。

1.3.3 提取物及萃取物的高效液相色譜檢測

采用1260型高效液相色譜儀進行檢測，配置二極管陣列檢測器，具體操作及參數見文獻[5]，同一保留時間峰面積越大表示含量越高。

1.3.4 ABTS+·清除能力

參考文獻[14-15]的方法并稍作修改。待測樣品采用100%甲醇溶解并定容至2 mg/mL，其中p-1和p-2樣品定容至4 mg/mL，并稀釋制成不同質量濃度的待測液。以山柰酚為對照，測定c-1、c-2、p-1、p-2、e-1、e-2、n-1和n-2樣品的ABTS+·清除能力。具體操作為：將7 mmol/L ABTS水溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫下避光反應16 h，使用前用無水乙醇稀釋，在734 nm波長處測定吸光度，調整混合液的吸光度為0.80±0.05，制成ABTS工作液。將10 μL不同質量濃度的供試品溶液加入96 孔板，然后每孔快速加入290 μL ABTS工作液，輕微振蕩混勻，立刻于黑暗中常溫反應15 min，測定實驗組在734 nm波長處的吸光度。以無水乙醇代替樣品測定空白組吸光度，以無水乙醇代替ABTS工作液測定背景組吸光度。ABTS+·清除率按公式（1）計算。

式中：A1表示實驗組吸光度；A0表示空白組吸光度；AB表示背景組吸光度。

根據測定的清除率計算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）以比較樣品之間ABTS+·清除能力。

1.3.5 DPPH自由基清除能力

待測樣品采用100%甲醇溶解并定容至2 mg/mL，其中p-1和p-2樣品定容至4 mg/mL，并稀釋制成不同質量濃度待測液。以山柰酚為對照，測定c-1、c-2、p-1、p-2、e-1、e-2、n-1和n-2樣品的DPPH自由基清除能力。具體操作為：稱取一定量的DPPH用純甲醇溶解并定容至終濃度100 μmol/L，4 ℃避光保存。DPPH自由基清除率的測定和計算方法參考文獻[2]。將不同質量濃度的樣品溶液與DPPH溶液等體積混合，室溫下避光靜置30 min后測定實驗組在517 nm波長處的吸光度，測定DPPH溶液與無水甲醇等體積混合的空白組吸光度，以及對應樣品溶液與無水甲醇等體積混合的背景組吸光度。DPPH自由基清除率按公式（2）計算。

式中：A1表示實驗組吸光度；A0表示空白組吸光度；AB表示背景組吸光度。

根據測定的清除率計算IC50以比較樣品之間DPPH自由基清除能力。

1.3.6 對H2O2損傷RAW264.7細胞的保護作用

1.3.6.1 細胞培養

RAW264.7細胞生長于含10%胎牛血清的培養液中，37 ℃、5% CO2環境下傳代培養，實驗用細胞為30 代內。實驗時取對數生長期細胞接種于96 孔板，調整每孔細胞數約為6×104個。96 孔板于37 ℃、5% CO2下培養12 h使細胞貼壁，移去培養基，磷酸鹽緩沖液清洗1 次，用于下一步實驗。

1.3.6.2 H2O2損傷模型的建立

H2O2損傷模型的建立按照文獻[16]的方法并稍作修改。已接種RAW264.7細胞的96 孔板中加入100 μL含有不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 mmol/L）H2O2溶液的培養基，每個樣品做4 個復孔。以加入100 μL DMEM培養基的孔為空白組，37 ℃、5% CO2下培養24 h。每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續培養4 h。棄上清液，加入150 μL DMSO，輕輕振蕩使紫色結晶溶解，室溫反應10 min后用酶標儀于490 nm波長處測定OD值。細胞抑制率按公式（3）計算。

式中：OD1表示實驗組OD值；OD0表示空白組OD值。

1.3.6.3 銀杏花粉樣品質量濃度的篩選

待測樣品采用DMSO溶解并定容至2 mg/mL，并用DMSO進一步稀釋制成不同質量濃度待測液。在已接種RAW264.7細胞的96 孔板中加入100 μL含有不同質量濃度（10、20、30、40、50、100 μg/mL）c-1、c-2、e-1、e-2樣品的培養基，每個樣品做4 個復孔。以加入100 μL DMEM培養基的孔為空白組，37 ℃、5% CO2下培養24 h。每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續培養4 h。棄上清液，加入150 μL DMSO，輕輕振蕩使紫色結晶溶解，室溫反應10 min后用酶標儀于490 nm波長處測定OD值，并按公式（3）計算細胞抑制率。

1.3.6.4 銀杏花粉樣品對H2O2損傷RAW264.7細胞的保護作用

在已接種RAW264.7細胞的96 孔板中加入100 μL含有0.2 mmol/L H2O2溶液和不同質量濃度（5、10、15 μg/mL）c-1、c-2、e-1、e-2樣品的培養基，每個樣品做4 個復孔。以加入100 μL DMEM培養基的孔為空白組，以加入含0.2 mmol/L H2O2的DMEM培養基的孔為損傷組，37 ℃、5% CO2下培養24 h。每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續培養4 h。棄上清液，加入150 μL DMSO，輕輕振蕩使紫色結晶溶解，室溫反應10 min后用酶標儀于490 nm處測定OD值，并按公式（3）計算細胞抑制率。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 銀杏花粉及其生物轉化產物的提取物和萃取物制備結果

前期篩選到一株L. perolens B2可生物轉化銀杏花粉黃酮苷，并對其發酵條件進行了優化。采用優化后的發酵條件對銀杏花粉進行發酵得到生物轉化產物，對銀杏花粉原料以及生物轉化產物進行提取和萃取，各部位的得率如表1所示。

表1 銀杏花粉及其生物轉化產物的提取物和萃取物的得率Table1 Yields of the crude extract, its biotransformation product and their fractions from Ginkgo biloba pollen

從表1可知，銀杏花粉通過生物轉化，提取物及其各相萃取物的得率均大幅度提高。這是由于銀杏花粉具有堅硬的孢壁[17]，活性成分被牢牢包裹在內部，同時其被花粉內部的蛋白、多糖等其他大分子成分包裹，活性成分不容易被提取。而乳酸菌可以分泌復雜的酶系[18-20]，分解孢壁中的部分成分，從而使孢壁形成孔洞，有利于活性成分的溶出。同時，乳酸菌具有分解蛋白質、多糖等大分子成分的能力，從而可以使花粉更好地釋放活性成分，提高活性成分提取物的得率，因此也相應提高了各相萃取物的得率。

2.2 提取物及萃取物的高效液相色譜圖分析

圖1 銀杏花粉及其生物轉化產物的提取物及萃取物的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of the crude extract,its biotransformation product and their fractions from G. biloba pollen

研究報道銀杏花粉主要抗氧化組分為黃酮類化合物，其中含量較高的為山柰酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和山柰酚，根據參考文獻[5]，上述黃酮類化合物分別對應圖1標注的色譜峰1～5。通過比較圖1A中c-1和c-2的高效液相色譜圖發現，生物轉化產物提取物中組分1、2、3的含量下降，其中山柰酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷（峰1）含量明顯降低，同時組分4、5含量升高，尤其是山柰酚（峰5）含量明顯升高。可見，通過L. perolens B2的生物轉化，銀杏花粉中的組分1、2、3被轉化為組分4、5。文獻[21]報道乳酸菌可分泌β-D-葡萄糖苷酶，因此可能是因為篩選的L. perolens B2可分泌β-D-葡萄糖苷酶，并且酶活力較高，組分1、3通過葡萄糖苷鍵的斷裂釋放出組分5。同理，組分2可被轉化為組分4，但可能L. perolens B2的α-L-鼠李糖苷酶活力較低，從而導致組分4有積累的現象。圖1B為石油醚相萃取物，黃酮組分峰面積大幅降低，表明其對黃酮類化合物沒有富集作用，但可萃取出提取物中的油溶性雜質。圖1C為正丁醇相萃取物，n-1樣品中富集了大量的組分1、2，而n-2樣品中組分1、2的含量很少，表明通過生物轉化，上述化合物被充分轉化為其他組分。圖1D為乙酸乙酯相萃取物，e-1樣品中主要富集了組分4，而e-2樣品中不僅富集了組分4，更富集了大量的組分5。本研究結果與文獻[22-23]基本一致，由于萃取溶劑的極性不同，根據“相似相溶”原理，乙酸乙酯相萃取物中的黃酮組分主要為黃酮醇及極性較低的黃酮苷，而正丁醇相中的黃酮組分主要為極性較高的黃酮苷。

2.3 體外抗氧化活性評價

圖2 銀杏花粉及其生物轉化產物的提取物及萃取物對ABTS＋ ·（A）和DPPH自由基（B）的清除作用Fig.2 ABTS＋· (A) and DPPH radical (B) scavenging activities of the crude extract, its biotransformation product and their fractions from G. biloba pollen

通過L. perolens B2的生物轉化，轉化產物的提取物和各相萃取物對ABTS+·和DPPH自由基的體外清除能力均有所提高（圖2）。其中e-2樣品對ABTS+·的清除率遠高于c-1（P＜0.05），同時，c-2、n-2、e-1、e-2和p-2樣品對DPPH自由基的清除率均高于c-1（P＜0.05），其中e-2樣品的DPPH自由基清除率最高。可見，乙酸乙酯相是銀杏花粉抗氧化活性物質的富集部位，這與文獻[24-25]的報道一致。同時通過L. perolens B2的生物轉化，銀杏花粉的體外抗氧化能力得到進一步提高，但與銀杏花粉中的主要黃酮苷元——山柰酚相比仍有明顯差距[26]。后續采用銀杏花粉及其轉化產物的提取物（c-1、c-2）和乙酸乙酯相萃取物（e-1、e-2）開展進一步的細胞抗氧化研究。

2.4 對H2O2損傷RAW264.7細胞的保護作用分析

2.4.1 H2O2損傷模型構建結果

如圖3所示，隨著濃度的升高，H2O2對RAW264.7細胞的抑制率不斷提高。與對照組相比，0.1、0.2 mmol/L的H2O2對RAW264.7細胞增殖沒有顯著影響（P＞0.05）；當濃度達到0.3 mmol/L時，H2O2對RAW264.7細胞的抑制率超過40%，對細胞增殖影響顯著（P＜0.05）。由于采用過低濃度的H2O2易造成操作誤差，或對細胞的氧化損傷不明顯，故選擇0.2 mmol/L H2O2進行細胞損傷模型的構建。

圖3 H2O2對RAW264.7細胞的毒性Fig.3 Cytotoxic effects of H2O2 on RAW264.7 cells

2.4.2 銀杏花粉樣品的質量濃度篩選結果

圖4 銀杏花粉樣品對RAW264.7細胞的毒性Fig.4 Cytotoxic effects of G. biloba pollen on RAW264.7 cells

由圖4可知，與對照組相比，10、20 μg/mL樣品對RAW264.7細胞增殖沒有顯著影響（P＞0.05），當質量濃度達到30 μg/mL時，4 種樣品對細胞增殖均具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。同時，當e-2樣品質量濃度為20 μg/mL時，對細胞的抑制率超過20%，表明該質量濃度的e-2樣品可能具有一定的細胞毒性，故選擇5、10、15 μg/mL的樣品質量濃度進行后續實驗。

2.4.3 銀杏花粉樣品對H2O2損傷RAW264.7細胞的保護作用分析

圖5 銀杏花粉樣品對H2O2損傷RAW264.7細胞的保護作用Fig.5 Protective effects of G. biloba pollen against H2O2-induced damage in RAW264.7 cells

研究低、中、高質量濃度（5、10、15 μg/mL）的c-1、c-2、e-1和e-2樣品對H2O2損傷RAW264.7細胞的保護作用，結果見圖5。供試的4 個樣品均可減緩由H2O2損傷導致的RAW264.7細胞凋亡，并且存在正向的劑量依賴關系，當質量濃度達到15 μg/mL時，4 個樣品的保護能力都達到最強，與損傷組相比差異顯著（P＜0.05）。轉化產物提取物及乙酸乙酯相萃取物的保護能力均強于對應銀杏花粉樣品，其中e-2樣品的保護能力最強，當e-2樣品質量濃度為15 μg/mL時，細胞抑制率為負，幾乎能夠完全保護RAW264.7細胞不受H2O2的損傷。

3 結 論

山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗抑郁等眾多功效[27-30]，本實驗證實，通過L. perolens B2的生物轉化，銀杏花粉中的山柰酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷等主要黃酮苷被轉化為以山柰酚為代表的黃酮苷元，同時提取物及各相萃取物的得率、體外抗氧化活性及對H2O2誘導損傷的RAW264.7細胞的保護作用均顯著提高。其中生物轉化產物的乙酸乙酯相萃取物的抗氧化活性最高，說明生物轉化后的抗氧化活性成分主要為富集于乙酸乙酯相的山柰酚。本研究為銀杏花粉資源的深入利用及開發高活性抗氧化產品提供了理論依據。