野山杏果肉總有機酸對高脂血癥大鼠血脂及相關基因表達的影響

阿依姑麗·艾合麥提，王妙穎，彭禛菲，馮雅麗，王小燕，古扎麗努爾·艾尼

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

高脂血癥是常見的心血管疾病，是動脈粥樣硬化等心腦血管疾病形成的一個主要危險因子[1-2]。據報道，全球每年死于心腦血管疾病的患者大約有1 200萬 人。有研究表明，我國成年人中血脂異常患者已達1.6億 人，患病率為18.6%[3]，對脂質代謝紊亂性疾病的預防和治療能夠改善外周動脈的病變和心腦血管疾病的發生[4]。因此，對高脂血癥的早期預防和將血脂控制于正常范圍就顯得十分重要。由于目前有效控制血脂的藥物大多為化學藥品，其有不同程度的副作用[5]，而以植物為基礎的非藥物飲食療法相對安全[6]；因此其越來越受到重視。

新疆的伊犁和哈密地區分布著豐富的野山杏資源，因其具有良好的防風固沙作用，加上國家的相關政策扶持，其種植栽培面積不斷擴大[7]，目前已超過26萬 km2；因此，對新疆野山杏這一特色資源的開發和利用具有重要的意義。對于野山杏果肉前期研究的結果表明，野山杏含有大量的膳食纖維、黃酮類[8-10]和豐富的有機酸類成分[11]，野山杏果肉總黃酮和膳食纖維具有良好的降血脂、抗氧化和保肝作用[9-10]，野山杏的總有機酸質量分數高達14.50%～27.77%，相比總黃酮（5.39%）高很多[12]，并且在臨床上應用野山杏果肉的水煎液治療脂肪肝可以使病情得到一定程度的改善（可以減輕或改善76.19%的脂肪肝）[13]，這些研究結果提示野山杏果肉中的總有機酸是其重要的活性成分。通過研究發現野山杏果肉總有機酸（total organic acids from wild apricot，TOAWA）在體外呈現一定的抑制過氧化脂質活性[14]以及降低高脂血癥小鼠的血脂濃度和保護肝臟的作用[15]。本研究通過考察TOAWA對高脂血癥大鼠血脂濃度、血清載脂蛋白（apoprotein，Apo）質量濃度及肝臟中與脂質代謝相關基因表達量的影響，探明TOAWA的降血脂機理，旨在為將TOAWA開發為降血脂的保健食品功能因子，將野山杏開發為降血脂的功能性食品原料提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（triglycerides，TG）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒、ApoA-I試劑盒、Apo-B試劑盒 南京建成生物工程研究所；血脂康膠囊 成都地奧九泓制藥廠；717陰離子交換樹脂、水合氯醛、羧甲基纖維素鈉、膽固醇、膽酸鹽、丙基硫氧嘧啶、1,2-丙二醇、吐溫-80、無水乙醇（分析純） 上海山浦化工有限公司；Prime Script II 1st Strand cDNA反轉錄酶試劑盒、SYBR Green Real Time PCR Master mix、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物 寶生物工程大連有限公司；Trizol、AL2000 DNA Marker南京鐘鼎生物技術有限公司；焦碳酸二乙酯 美國Sigma公司。

野山杏（Prunus armeniaca L.）產自新疆哈密伊吾縣葦子峽鄉。健康雌雄各半的SD大鼠，體質量（150±20）g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（新）2016-0003。

1.2 儀器與設備

酶標儀 美國BIO-RAD公司；紫外-可見分光光度計日本島津公司；渦漩混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；熒光定量PCR儀 德國Roche公司；臺式高速冷凍離心機 美國BECKMAN公司；紫外透射儀、恒溫水浴鍋 美國Amersham Pharmacia公司；雪花狀制冰機日本SANYO公司；超聲波藥物處理機 濟寧新百特工程機械有限公司；旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；真空抽濾泵 北京萊伯泰科儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；0～4 000 r/min離心沉淀器 金壇市醫療器械廠；電子天平 梅勒特托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TOAWA的制備

野山杏果肉干粉用蒸餾水80 ℃回流提取兩次，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液用717型強堿性陰離子交換樹脂作為吸附柱，稀HCl溶液作洗脫液進行分離純化，再用正丁醇萃取分離，減壓回收正丁醇，殘渣干燥即得淡棕色的總有機酸純品，采用電位滴定法[16]測定其含量為845.4 mg/g。

1.3.2 高脂乳劑及樣品溶液的制備

按文獻[17]制備高脂乳劑，將總有機酸和血脂康分別用質量分數0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成相應的質量濃度。

1.3.3 動物分組、造模與給藥

SD大鼠60 只，隨機分為6 組，每組10 只，雌雄各半，分為空白組、模型組、陽性組以及TOAWA低、中、高劑量組。空白組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液（10 mL/（kg·d）），其余5 組均于每天上午灌胃高脂乳劑（10 mL/（kg·d）），其中陽性組和3 個不同劑量TOAWA組均于下午在灌胃高脂乳劑的基礎上，分別灌胃血脂康（0.2 g/（kg·d））和低、中、高3 個劑量（0.1、0.2、0.4 g/（kg·d））的TOAWA，實驗周期60 d，為及時調整給藥劑量，大鼠每5 d稱體質量一次，于末次給藥后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，心臟采血，分離血清用于血清生化指標的測定，脫臼處死，摘取肝臟稱質量，并按下式計算肝臟指數；同時快速分離肝右小葉供制作組織切片使用，剩余的肝臟剪下1.0～1.5 g迅速用4 ℃生理鹽水洗凈置于液氮中，用于提取肝臟DNA。

1.3.4 血清生化指標測定

取1.3.3節制備的血清，按照試劑盒方法測定TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度以及ApoA-I、Apo-B質量濃度，并計算ApoA-I/Apo-B，考察TOAWA對實驗大鼠血脂濃度及Apo質量濃度的影響。

1.3.5 肝臟組織切片的制作和組織學檢查

取1.3.3節中分離的肝右小葉用生理鹽水洗凈，用體積分數10%中性甲醛溶液固定，制作病理切片并進行蘇木精-伊紅染色，生物顯微鏡（400×）觀察各組肝組織切片病理學變化。

1.3.6 肝臟組織總RNA提取及反轉錄合成cDNA

取1.3.3節肝臟組織，采用Trizol法提取和純化肝臟組織中的總RNA[18-19]，使用GelStain染色，采用瓊脂糖凝膠電泳技術檢測RNA的完整性。取RNA樣本，采用Prime Script II 1st Strand cDNA反轉錄酶試劑盒反轉錄合成cDNA。合成的目標產物cDNA置于－70 ℃保存。

1.3.7 實時熒光定量PCR測定肝臟組織中與脂質代謝相關基因的mRNA表達

取1.3.6節中反轉錄合成的cDNA樣本，根據基因序列設計特異性引物，通過實時熒光定量PCR，采用SYBR GREEN染料法，以β-actin為內參基因作定量檢測，并用2－△△Ct法對數據進行分析。實時熒光定量PCR采用兩步法，程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環40 次；72 ℃單點檢測信號。溶解曲線：95 ℃ 0 s；65 ℃ 15 s；95 ℃ 0 s，連續檢測信號。大鼠肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPAR-α）和低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDL-R）引物的設計見表1。

表1 基因引物序列Table1 Primer sequences of the genes

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 TOAWA對實驗大鼠體質量和肝臟指數的影響

圖1 實驗大鼠的體質量增長曲線Fig.1 Growth curve of experimental rats

圖2 TOAWA對實驗大鼠肝臟指數的影響Fig.2 Effect of TOAWA on liver index of experimental rats

圖1 顯示各組實驗大鼠的體質量之間無明顯差異。圖2顯示，與空白組相比，模型組大鼠的肝臟指數極顯著升高（P＜0.01），說明高脂乳劑使得肝臟被脂肪浸潤，損傷肝臟；與模型組比較，TOAWA低、中、高劑量組和陽性組均可極顯著降低肝臟指數（P＜0.01），說明TOAWA能夠明顯減輕肝臟的脂肪浸潤，改善肝功能。

2.2 TOAWA對實驗大鼠血脂濃度的影響

圖3顯示，與空白組相比，模型組TG、TC和LDL-C濃度極顯著升高（P＜0.01），HDL-C濃度極顯著降低（P＜0.01），表明成功誘導構建大鼠高脂血癥模型。與模型組比較，TOAWA低、中、高劑量組與陽性組均可顯著降低TC、TG和LDL-C濃度，明顯升高HDL-C濃度，提示TOAWA能調節高脂血癥大鼠血脂濃度，高劑量組的作用效果更為明顯。

圖3 TOAWA對高血脂大鼠血清中血脂濃度的影響Fig.3 Effect of TOAWA on serum lipid level of hyperlipidemic rats

2.3 TOAWA對實驗大鼠血清Apo質量濃度的影響

圖4 TOAWA對高血脂癥大鼠血清Apo質量濃度的影響Fig.4 Effect of TOAWA on serum apolipoprotein level of hyperlipidemic rats

圖4 顯示，與空白組相比，模型組ApoA-I質量濃度和ApoA-I/Apo-B極顯著降低（P＜0.01），Apo-B質量濃度極顯著升高（P＜0.01），表明模型組大鼠血清Apo的質量濃度異常。與模型組比較，TOAWA高劑量組與陽性組可極顯著升高ApoA-I質量濃度和ApoA-I/Apo-B（P＜0.01），顯著降低Apo-B質量濃度，低、中劑量TOAWA能夠不同程度地升高ApoA-I質量濃度和ApoA-I/Apo-B，降低Apo-B質量濃度，提示TOAWA通過調節高脂血癥大鼠血清Apo質量濃度而影響血脂濃度，高劑量組的作用效果更為明顯。

2.4 大鼠肝臟組織的病理學觀察

圖5 TOAWA對大鼠肝臟組織病理學變化的影響（×400）Fig.5 Effect of TOAWA on pathological changes of liver tissue in rats (× 400)

圖5 顯示空白組肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀且排列規律、整齊、肝竇正常，周邊肝細胞結構正常，未見細胞膨脹及病理形態變化；與空白組相比，模型組可見肝臟體積變大，肝細胞索結構紊亂，肝細胞之間連接松散，含有較多的白色脂肪油滴，形成了空泡，細胞核被擠向一側，呈現明顯的脂肪性病變；給予不同質量濃度TOAWA和血脂康灌胃后，TOAWA低、中、高劑量組的脂肪變性有不同程度的改善，細胞形態開始恢復，其中高劑量組的脂肪病變減少更為顯著，大部分細胞恢復到接近正常形態；陽性組肝索和肝竇結構清晰，中央靜脈周圍肝細胞恢復放射狀且排列整齊，脂肪油滴明顯減少，肝臟切片基本恢復到正常狀態。

2.5 大鼠肝臟組織的RNA電泳檢測結果

圖6 大鼠肝臟組織的RNA電泳檢測結果Fig.6 Electrophoretic detection of RNA extracted from rat liver tissue

圖6 顯示，肝臟中RNA提取成功，采用GelStain染色及瓊脂糖凝膠電泳技術檢測到RNA完整度好，可以繼續進行后續的實時熒光定量PCR實驗。

2.6 大鼠肝臟組織中脂質代謝相關基因的mRNA的表達

圖7顯示，與空白組相比，模型組的PPAR-α和LDL-R基因表達量降低，說明高脂模型組的脂質代謝能力降低；與模型組相比，TOAWA低、中、高劑量組和陽性組PPAR-α和LDL-R基因表達量有明顯的升高，特別是高劑量組與空白組幾乎無差異，說明高劑量組大鼠脂質代謝能力恢復到正常水平。

圖7 大鼠肝臟PPAR-α和LDL-R基因mRNA表達量Fig.7 PPAR-α and LDL-R mRNA expression in liver of rats

3 討 論

隨著人們生活水平的提高，飲食結構發生了改變，飲食中蛋白和脂肪的比例增加，運動量相對減少[20]，導致血中脂肪聚積，引起脂質代謝紊亂，而脂質代謝紊亂誘發的高脂血癥是導致心腦血管疾病蔓延和惡化的重要風險因素[21]。血清TC、TG、LDL-C濃度等指標中一種以上超過正常最高限值，而HDL-C濃度低于正常最低限值是高脂血癥的具體表現。因此，使血清TC、TG及LDL-C濃度降低或HDL-C濃度升高均可使高脂血癥得到一定程度的改善。本研究結果表明，給予TOAWA干預能夠使實驗大鼠血清TC、TG、LDL-C濃度降低和HDL-C濃度升高，呈現良好的降血脂作用。

PPAR-α作為重要的脂類代謝調控因子，主要分布在肝臟中，其能夠促進脂肪酸從血漿轉運蛋白上釋放并被細胞吸收[22-23]，增加了脂肪酸的利用率，減少了TG的合成。肝臟中PPAR-α基因表達的上調可使肝臟對脂質的代謝能力增強，使TG濃度顯著降低，同時，其能夠增加肝臟脂肪酸的氧化，進一步減少TG的合成和分泌，從而降低血脂濃度[24-26]。LDL-R是體內清除膽固醇的主要途徑，肝細胞中的LDL-R在血脂代謝，特別是膽固醇代謝過程中發揮重要作用，而LDL-R的數量和活性在分子水平受基因表達的調控[27]，高脂飲食可抑制肝臟LDL-R基因轉錄，使其表達量降低，從而減少LDL-R的數量[28]。本研究結果表明，TOAWA通過上調肝臟中PPAR-α基因的表達水平減少TG的合成和分泌，從而降低血清中TG濃度；通過上調肝臟中LDL-R基因的表達水平增加肝臟對膽固醇的降解，從而降低血清TC濃度。

ApoA-I為調節HDL-C的主要Apo，能夠清除膽固醇和防止周圍組織脂質沉積，參與膽固醇從外周到肝臟的逆向轉運過程，呈現抗動脈粥樣硬化作用[29-30]。肝臟中的TG除可在線粒體、微粒體等部位進行氧化供能外，還可以通過組裝至Apo-B中，形成極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein cholesterol，VLDL）分泌入血液，使動脈粥樣硬化的風險增加，肝臟VLDL組裝和分泌障礙也可導致脂肪肝的發生[31-32]。本研究結果表明，TOAWA通過提高血清ApoA-I的質量濃度和ApoA-I/Apo-B使血清中HDL-C濃度升高，增加了膽固醇自外周向肝臟的逆向轉運和在肝臟中的降解，清除了血清膽固醇，使得血清膽固醇濃度進一步降低；通過降低血清Apo-B質量濃度，抑制了VLDL組裝和分泌，從而使得LDL-C的合成減少。

綜上所述，TOAWA通過上調肝臟中PPAR-α和LDL-R基因、提高血清ApoA-I質量濃度和ApoA-I/Apo-B、降低Apo-B質量濃度以及改善肝功能等多個途徑發揮降血脂的作用，使高脂血癥實驗大鼠血清學指標恢復到接近正常水平。